د امیونوموډولټري میټابولیتونه د تومور مایکرو چاپیریال (TME) یوه مهمه ځانګړتیا ده، مګر د یو څو استثناوو سره، د دوی هویت په پراخه کچه نامعلوم پاتې دی. دلته، موږ د لوړ درجې سیروس کارسنوما (HGSC) ناروغانو د تومورونو او اسایټونو څخه تومورونه او T حجرات تحلیل کړل ترڅو د دې مختلف TME برخو میټابولوم څرګند کړي. اسایټونه او د تومور حجرات پراخه میټابولیت توپیرونه لري. د اسایټونو په پرتله، د تومور نفوذ کونکي T حجرات په 1-میتیل نیکوټینامایډ (MNA) کې د پام وړ بډایه شوي دي. که څه هم په T حجرو کې د MNA کچه لوړه شوې، د نیکوټینامایډ N-میتیل ټرانسفریز (یو انزایم چې د S-اډینوسل میتیونین څخه نیکوټینامایډ ته د میتیل ګروپونو لیږد کتلیز کوي) څرګندونه فایبروبلاستونو او د تومور حجرو پورې محدوده ده. په فعاله توګه، MNA د T حجرات هڅوي چې د تومور هڅوونکي سایټوکین تومور نیکروسس فاکتور الفا تولید کړي. له همدې امله، د TME څخه اخیستل شوی MNA د T حجرو د معافیت تنظیم کې مرسته کوي او د انسان د سرطان درملنې لپاره د معافیت درملنې احتمالي هدف استازیتوب کوي.
د تومور څخه ترلاسه شوي میټابولیتونه کولی شي د تومور ضد معافیت باندې ژور مخنیوی اغیزه ولري، او ډیر او ډیر شواهد ښیې چې دوی کولی شي د ناروغۍ پرمختګ لپاره د کلیدي محرک ځواک په توګه هم کار وکړي (1). د واربرګ اغیزې سربیره، وروستي کار د تومور حجرو میټابولیک حالت او د تومور مایکرو چاپیریال (TME) د معافیت حالت سره د هغې اړیکې مشخص کولو لپاره پیل کړی. د موږک ماډلونو او د انسان T حجرو مطالعاتو ښودلې چې ګلوټامین میټابولیزم (2)، اکسیډیټیو میټابولیزم (3) او ګلوکوز میټابولیزم (4) کولی شي په خپلواکه توګه د معافیت حجرو په مختلفو فرعي ګروپونو عمل وکړي. پدې لارو کې ډیری میټابولیتونه د T حجرو د تومور ضد فعالیت مخه نیسي. دا ثابته شوې چې د کوینزیم ټیټراهایډروبیوپټرین (BH4) بندیدل کولی شي د T حجرو تکثیر ته زیان ورسوي، او په بدن کې د BH4 زیاتوالی کولی شي د CD4 او CD8 لخوا منځګړیتوب شوي د تومور ضد معافیت غبرګون ته وده ورکړي. سربیره پردې، د کاینورینین معافیت ضد اغیز د BH4 (5) ادارې لخوا ژغورل کیدی شي. په ایزوسیټریټ ډیهایډروجنیز (IDH) میوټینټ ګلیوبلاستوما کې، د انانټیومیټابولیک (R)-2-هایډروکسیګلوټاریټ (R-2-HG) سرایت د T حجرو فعالولو، تکثیر او سایټولیسس فعالیت مخه نیسي (6). په دې وروستیو کې، دا ښودل شوي چې میتیلګلیوکسال، د ګلایکولیسس فرعي محصول، د مایلایډ اصل د سپریسر حجرو لخوا تولید کیږي، او د میتیلګلیوکسال د T حجرو لیږد کولی شي د انفکټور T حجرو فعالیت مخه ونیسي. په درملنه کې، د میتیلګلیوکسال بې طرفه کول کولی شي د مایلایډ څخه اخیستل شوي سپریسر حجرو (MDSC) فعالیت باندې بریالي شي او په موږک ماډلونو کې په همغږۍ سره د چیک پوائنټ بلاکډ درملنه لوړه کړي (7). دا مطالعات په ګډه د T حجرو فعالیت او فعالیت تنظیم کولو کې د TME څخه اخیستل شوي میټابولیتونو کلیدي رول باندې ټینګار کوي.
د تخمدان په سرطان کې د T حجرو اختلال په پراخه کچه راپور شوی دی (8). دا تر یوې اندازې پورې د هایپوکسیا او غیر معمولي تومور رګونو کې د میټابولیک ځانګړتیاو له امله دی (9)، کوم چې د ګلوکوز او ټریپټوفان د فرعي محصولاتو لکه لیکټیک اسید او کاینورینین بدلولو پایله لري. ډیر خارجي حجروي لیکټیټ د انټرفیرون-γ (IFN-γ) تولید کموي او د مایلوسوپریسیو فرعي ګروپونو توپیر رامینځته کوي (10، 11). د ټریپټوفان مصرف په مستقیم ډول د T حجرو تکثیر مخنیوی کوي او د T حجرو ریسیپټر سیګنالینګ مخه نیسي (12-14). د دې مشاهدو سره سره، د معافیت میټابولیزم شاوخوا ډیر کار د مطلوب میډیا په کارولو سره په ان ویټرو T حجرو کلتور کې ترسره شوی، یا په ویوو کې د هوموولوګس موږک ماډلونو پورې محدود دی، چې هیڅ یو یې په بشپړ ډول د انسان سرطان او فزیولوژیکي میکرو او مایکرو چاپیریال متفاوت نه منعکس کوي.
د تخمدان د سرطان یوه عامه ځانګړتیا د پیریټونیل خپریدل او د اسایټ ظاهري بڼه ده. په اسایټونو کې د حجرو د مایعاتو راټولیدل د پرمختللي ناروغۍ او ضعیف تشخیص سره تړاو لري (15). د راپورونو له مخې، دا ځانګړی برخه هایپوکسیک ده، د رګونو انډوتیلیل ودې فاکتور (VEGF) او انډولامین 2,3-ډای اکسیجنیز (IDO) لوړه کچه لري، او د T تنظیمي حجرو او مایلایډ مخنیوی حجرو (15-18) لخوا نفوذ کیږي. د اسایټونو میټابولیک چاپیریال ممکن د تومور څخه توپیر ولري، نو د پیریټونیل ځای کې د T حجرو بیا پروګرام کول روښانه ندي. سربیره پردې، د تومور چاپیریال کې د اسایټونو او میټابولیتونو ترمنځ کلیدي توپیرونه او متفاوتیت ممکن د معافیت حجرو نفوذ او په تومورونو کې د دوی فعالیت مخه ونیسي، او نورو څیړنو ته اړتیا ده.
د دې ستونزو د حل لپاره، موږ د حجرو د حساس جلا کولو او مایع کروماتګرافي ټنډیم ماس سپیکٹرومیټري (LC-MS/MS) طریقه ډیزاین کړه ترڅو د حجرو مختلف ډولونه (د CD4 + او CD8 + T حجرو په شمول) مطالعه کړو او همدارنګه د تومورونو دننه او ترمنځ د دې میټابولایټونه د ناروغ په ورته اسایټ او تومور چاپیریال کې حجرې پراخوي. موږ دا طریقه د لوړ ابعادي جریان سایټومیټري او واحد حجرو RNA ترتیب (scRNA-seq) سره په ګډه کاروو ترڅو د دې کلیدي نفوس میټابولیک حالت خورا حل شوی انځور چمتو کړو. دې طریقې د تومور T حجرو کې د 1-میتیل نیکوټینامایډ (MNA) په کچه کې د پام وړ زیاتوالی څرګند کړ، او په ویټرو تجربو کې ښودل شوي چې د T حجرو فعالیت باندې د MNA د معافیتي اغیز دمخه نامعلوم و. په عمومي توګه، دا طریقه د تومورونو او معافیتي حجرو ترمنځ متقابل میټابولیک تعاملات څرګندوي، او د معافیت تنظیم میټابولایټونو ته ځانګړي بصیرت چمتو کوي، کوم چې ممکن د T حجرو پر بنسټ د تخمدان سرطان معافیتي درملنې لپاره ګټور وي. د درملنې فرصتونه.
موږ د لوړ ابعادي جریان سایټومیټري څخه کار واخیست ترڅو په ورته وخت کې د ګلوکوز جذب اندازه کړو [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) او مایټوکونډریال فعالیت [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) د څنګ په څنګ ځانګړي مارکرونه دي چې د معافیت حجرو او د تومور حجرو نفوس توپیر کوي (جدول S2 او شکل S1A). دې تحلیل ښودلې چې د T حجرو په پرتله، اسایټس او د تومور حجرې د ګلوکوز جذب لوړه کچه لري، مګر د مایټوکونډریال فعالیت کې کوچني توپیرونه لري. د تومور حجرو اوسط ګلوکوز جذب [CD45-EpCAM (EpCAM)+] د T حجرو په پرتله درې څخه تر څلور ځله دی، او د CD4 + T حجرو اوسط ګلوکوز جذب د CD8 + T حجرو په پرتله 1.2 ځله دی، کوم چې دا په ګوته کوي چې د تومور نفوذ کونکي لیمفوسایټس (TIL) حتی په ورته TME کې مختلف میټابولیک اړتیاوې لري (شکل 1A). په مقابل کې، په تومور حجرو کې د مایټوکونډریال فعالیت د CD4 + T حجرو سره ورته دی، او د دواړو حجرو ډولونو د مایټوکونډریال فعالیت د CD8 + T حجرو په پرتله لوړ دی (شکل 1B). په عمومي توګه، دا پایلې د میټابولیک کچه څرګندوي. د تومور حجرو میټابولیک فعالیت د CD4 + T حجرو په پرتله لوړ دی، او د CD4 + T حجرو میټابولیک فعالیت د CD8 + T حجرو په پرتله لوړ دی. د حجرو ډولونو په اوږدو کې د دې اغیزو سره سره، د CD4 + او CD8 + T حجرو میټابولیک حالت یا د تومورونو په پرتله په اسایټونو کې د دوی نسبي تناسب کې هیڅ دوامداره توپیر شتون نلري (شکل 1C). برعکس، د CD45-حجرو په برخه کې، په تومور کې د EpCAM+ حجرو تناسب د اسایټونو په پرتله زیات شوی (شکل 1D). موږ د EpCAM+ او EpCAM- حجرو اجزاو ترمنځ یو روښانه میټابولیک توپیر هم ولید. د EpCAM+ (تومور) حجرات د EpCAM- حجرو په پرتله د ګلوکوز لوړ جذب او مایټوکونډریل فعالیت لري، کوم چې د TME په تومور حجرو کې د فایبروبلاستونو میټابولیک فعالیت څخه ډیر لوړ دی (شکل 1، E او F).
(A او B) د ګلوکوز جذب (2-NBDG) (A) او د CD4 + T حجرو د مایټوکونډریال فعالیت (MitoTracker تیاره سور) (B) د استازو ګرافونه (کیڼ اړخ ته) او جدول شوي معلومات (ښي اړخ ته)، د CD8 + T حجرو او EpCAM + CD45-تومور حجرو د اسایټ او تومور څخه. (C) د اسایټ او تومور کې د CD4 + او CD8 + حجرو (د CD3 + T حجرو) تناسب. (D) د اسایټ او تومور کې د EpCAM + تومور حجرو تناسب (CD45−). (E او F) د EpCAM + CD45-تومور او EpCAM-CD45-میټریکس ګلوکوز جذب (2-NBDG) (E) او مایټوکونډریال فعالیت (MitoTracker تیاره سور) (F) د استازو ګرافونه (کیڼ اړخ ته) او جدول شوي معلومات (ښي اړخ ته) اسایټ او تومور حجرې. (G) د جریان سایټومیټري لخوا د CD25، CD137 او PD1 څرګندونه استازي ګرافونه. (H او I) په CD4 + T حجرو (H) او CD8 + T حجرو (I) کې د CD25، CD137 او PD1 څرګندونه. (J ​​او K) ساده، مرکزي حافظه (Tcm)، اغیز کوونکی (Teff) او اغیز کوونکی حافظه (Tem) فینوټایپونه د CCR7 او CD45RO د څرګندولو پر بنسټ. د CD4 + T حجرو (J) او CD8 + T حجرو (K) په اسایټس او تومورونو کې د استازو انځورونه (کیڼ اړخ) او جدول معلومات (ښي اړخ). د P ارزښتونه د جوړه شوي t-ټیسټ (*P<0.05، **P<0.01 او ***P<0.001) لخوا ټاکل شوي. دا کرښه د مطابقت لرونکو ناروغانو استازیتوب کوي (n = 6). FMO، فلوروسینس منفي یو؛ MFI، د میډین فلوروسینس شدت.
نور تحلیل د لوړ حل شوي T حجرو فینوټایپیک حالت ترمنځ نور مهم توپیرونه هم څرګند کړل. په تومورونو کې فعال شوي (شکل 1، G څخه I) او د تاثیر کونکي حافظه (شکل 1، J او K) د اسایټس (د CD3 + T حجرو تناسب) په پرتله ډیر ځله شتون لري. په ورته ډول، د فعالولو مارکرونو (CD25 او CD137) او د کمښت مارکرونو [پروګرام شوي حجرو مړینې پروټین 1 (PD1)] د څرګندولو له لارې د فینوټایپ تحلیل ښودلې چې که څه هم د دې نفوس میټابولیک ځانګړتیاوې توپیر لري (شکل S1، B څخه E)، مګر د ساده، تاثیر کونکي یا حافظې فرعي سیټونو (شکل S1، F څخه I) ترمنځ هیڅ مهم میټابولیک توپیرونه په دوامداره توګه نه لیدل شوي. دا پایلې د ماشین زده کړې میتودونو په کارولو سره تایید شوې ترڅو په اتوماتيک ډول د حجرو فینوټایپونه (21) وټاکي، کوم چې د ناروغ په اسایټس (شکل S2A) کې د هډوکي میرو حجرو (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) لوی شمیر شتون نور هم څرګند کړ. د ټولو پیژندل شویو حجرو ډولونو په منځ کې، د دې مایلایډ حجرو نفوس د ګلوکوز لوړ جذب او مایټوکونډریال فعالیت ښودلی (شکل S2، B څخه تر G پورې). دا پایلې د HGSC ناروغانو کې د اسایټس او تومورونو کې موندل شوي څو حجرو ډولونو ترمنځ قوي میټابولیک توپیرونه روښانه کوي.
د TIL د میټابونومیک ځانګړتیاو په پوهیدو کې اصلي ننګونه د تومورونو څخه د کافي پاکوالي، کیفیت او مقدار لرونکي T حجرو نمونو جلا کولو اړتیا ده. وروستیو مطالعاتو ښودلې چې د جریان سایټومیټري پراساس د ترتیب کولو او د مڼو د غني کولو میتودونه ممکن د حجرو میټابولایټ پروفایلونو کې بدلونونو لامل شي (22-24). د دې ستونزې د له منځه وړلو لپاره، موږ د مڼو د غني کولو میتود غوره کړ ترڅو د LC-MS/MS لخوا تحلیل دمخه د جراحي له لارې د انسان د تخمدان سرطان څخه TIL جلا او جلا کړو (مواد او میتودونه وګورئ؛ شکل 2A). د میټابولایټ بدلونونو باندې د دې پروتوکول عمومي اغیز ارزولو لپاره، موږ د پورته مڼو د جلا کولو مرحلې وروسته د صحي بسپنه ورکوونکو لخوا فعال شوي د T حجرو میټابولایټ پروفایلونه د هغو حجرو سره پرتله کړل چې مڼې جلا شوي نه وو مګر په یخ کې پاتې شوي وو. د کیفیت کنټرول دې تحلیل وموندله چې د دې دوو شرایطو ترمنځ لوړ اړیکه شتون لري (r = 0.77)، او د 86 میټابولایټونو ګروپ تخنیکي تکرار لوړ تکرار وړتیا لري (شکل 2B). له همدې امله، دا طریقې کولی شي په حجرو کې دقیق میټابولایټ تحلیل ترسره کړي چې د حجرو ډول غني کولو لاندې دي، پدې توګه په HGSC کې د ځانګړو میټابولایټونو پیژندلو لپاره لومړی لوړ ریزولوشن پلیټ فارم چمتو کوي، په دې توګه خلکو ته دا توان ورکوي چې د حجرو ځانګړتیاو ژوره پوهه ترلاسه کړي. د جنسي میټابولیزم پروګرام.
(الف) د مقناطیسي مڼو د غني کولو سکیمیک ډیاګرام. د LC-MS/MS لخوا د تحلیل دمخه، حجرې به د مقناطیسي مڼو د غني کولو درې پرله پسې پړاوونه تیر کړي یا په یخ کې پاتې شي. (ب) د میټابولایټونو په کثرت باندې د غني کولو ډول اغیزه. د هر غني کولو ډول ± SE لپاره د دریو اندازه کولو اوسط. خړ کرښه د 1:1 اړیکه استازیتوب کوي. د تکرار اندازه کولو داخلي ټولګي اړیکه (ICC) د محور لیبل کې ښودل شوي. NAD، نیکوتینامایډ اډینین ډینوکلیوټایډ. (ج) د ناروغ میټابولایټ تحلیل د کاري فلو سکیمیک ډیاګرام. اسایټس یا تومورونه د ناروغانو څخه راټول شوي او کریوپریزر شوي دي. د هرې نمونې یوه کوچنۍ برخه د جریان سایټومیټري لخوا تحلیل شوې، پداسې حال کې چې پاتې نمونې د CD4+، CD8+ او CD45- حجرو لپاره د غني کولو درې پړاوونه تیر شوي. دا حجروي برخې د LC-MS/MS په کارولو سره تحلیل شوي. (د) د معیاري میټابولایټ کثرت د تودوخې نقشه. ډینډروګرام د نمونو ترمنځ د یوکلیډین فاصلو د وارډ کلسترینګ استازیتوب کوي. (ه) د نمونې میټابولایټ نقشې د اصلي برخې تحلیل (PCA)، د هر نمونې درې نقلونه ښیې، د ورته ناروغ نمونې د یوې کرښې په واسطه وصل دي. (ف) د نمونې د میټابولایټ پروفایل PCA چې په ناروغ باندې شرط شوی (د بیلګې په توګه، د جزوي بې ځایه کیدو کارول)؛ د نمونې ډول د محدب خولۍ لخوا محدود دی. PC1، اصلي برخه 1؛ PC2، اصلي برخه 2.
بیا، موږ د غني کولو دا طریقه د شپږو HGSC ناروغانو په لومړنيو اسایټونو او تومورونو کې د CD4 +، CD8 + او CD45 حجرو برخو کې د 99 میټابولیتونو تحلیل لپاره پلي کړه (شکل 2C، شکل S3A او جدول S3 او S4). د ګټو نفوس د ژوندیو حجرو د اصلي لوی نمونې له 2٪ څخه تر 70٪ پورې حساب کوي، او د حجرو تناسب د ناروغانو ترمنځ خورا توپیر لري. د مڼو جلا کولو وروسته، د ګټو غني شوی برخه (CD4+، CD8+ یا CD45-) په اوسط ډول په نمونه کې د ټولو ژوندیو حجرو له 85٪ څخه ډیر حساب کوي. دا غني کولو طریقه موږ ته اجازه راکوي چې د انسان د تومور نسج میټابولیزم څخه د حجرو نفوس تحلیل کړو، کوم چې د لویو نمونو څخه ترسره کول ناممکن دي. د دې پروتوکول په کارولو سره، موږ معلومه کړه چې l-kynurenine او adenosine، دا دوه ښه مشخص شوي معافیت ضد میټابولیتونه د تومور T حجرو یا تومور حجرو کې لوړ شوي (شکل S3، B او C). له همدې امله، دا پایلې زموږ د حجرو جلا کولو او ډله ایز سپیکرومیټري ټیکنالوژۍ وفاداري او وړتیا ښیې چې د ناروغ په نسجونو کې بیولوژیکي پلوه مهم میټابولیتونه ومومي.
زموږ تحلیل د ناروغانو دننه او د ناروغانو ترمنځ د حجرو ډولونو قوي میټابولیک جلاوالی هم څرګند کړ (شکل 2D او شکل S4A). په ځانګړې توګه، د نورو ناروغانو په پرتله، ناروغ 70 مختلف میټابولیک ځانګړتیاوې ښودلې (شکل 2E او شکل S4B)، چې دا په ګوته کوي چې ممکن د ناروغانو ترمنځ د پام وړ میټابولیک هیتروجنیت شتون ولري. دا د یادونې وړ ده چې د نورو ناروغانو په پرتله (1.2 څخه تر 2 لیټرو؛ جدول S1)، په ناروغ 70 (80 ملی لیتر) کې راټول شوي د اسایټونو ټول مقدار کوچنی و. د اصلي اجزاو تحلیل په جریان کې د ناروغانو ترمنځ هیتروجنیت کنټرول (د مثال په توګه، د جزوي بې ځایه کیدو تحلیل کارول) د حجرو ډولونو ترمنځ دوامداره بدلونونه ښیې، او د حجرو ډولونه او/یا مایکرو چاپیریال په روښانه ډول د میټابولایټ پروفایل سره سم راټول شوي (شکل 2F). د واحد میټابولایټونو تحلیل په دې اغیزو ټینګار وکړ او د حجرو ډولونو او مایکرو چاپیریال ترمنځ د پام وړ توپیرونه یې څرګند کړل. دا د یادونې وړ ده چې ترټولو سخت توپیر لیدل شوی MNA دی، کوم چې معمولا په CD45- حجرو او په CD4+ او CD8+ حجرو کې بډایه کیږي چې تومور ته ننوځي (شکل 3A). د CD4 + حجرو لپاره، دا اغیزه خورا څرګنده ده، او په CD8 + حجرو کې MNA هم د چاپیریال لخوا په کلکه اغیزمن کیږي. په هرصورت، دا مهمه نده، ځکه چې د شپږو ناروغانو څخه یوازې درې یې د تومور CD8+ نمرو لپاره ارزول کیدی شي. د MNA سربیره، د اسایټس او تومورونو په مختلفو ډولونو حجرو کې، نور میټابولیتونه چې په TIL کې ضعیف مشخص شوي هم په توپیر سره بډایه دي (شکلونه S3 او S4). له همدې امله، دا معلومات د نورو څیړنو لپاره د معافیتي موډولیټریټ میټابولیتونو یوه ژمنه کونکې سیټ څرګندوي.
(الف) د CD4+، CD8+ او CD45- حجرو کې د MNA نورمال شوی مواد د اسایټس او تومور څخه. د بکس پلاټ میډین (کرښه)، انټرکوارټیل رینج (فریم هینج) او ډیټا رینج ښیې، د انټرکوارټیل رینج (فریم ویسکر) څخه تر 1.5 ځله پورې. لکه څنګه چې د ناروغانو موادو او میتودونو کې تشریح شوي، د P ارزښت (*P<0.05 او **P<0.01) ټاکلو لپاره د ناروغ لیما ارزښت وکاروئ. (ب) د MNA میټابولیزم سکیمیک ډیاګرام (60). میټابولایټونه: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. انزایمونه (شنه): NNMT، نیکوتینامایډ N-میتیل ټرانسفریز؛ SIRT، سیرټوینز؛ NAMPT، نیکوتینامایډ فاسفوریبوسیل ټرانسفریز؛ AOX1، الډی هایډ اکسیډیز 1؛ NRK، نیکوتینامایډ رایبوسایډ کایناز؛ NMNAT، نیکوتینامایډ مونو نیوکلیوټایډ اډینیلیټ ټرانسفریز؛ Pnp1، پیورین نیوکلیوسایډ فاسفوریلاز. (C) د اسایټس (خړ) او تومور (سور؛ n = 3 ناروغان) د scRNA-seq t-SNE. (D) د scRNA-seq په کارولو سره پیژندل شوي په مختلفو حجرو نفوس کې د NNMT څرګندونه. (E) د SK-OV-3، د انسان جنیني پښتورګي (HEK) 293T، T حجرو او MNA-درملنه شوي T حجرو کې د NNMT او AOX1 څرګندونه. پوښل شوی څرګندونه د SK-OV-3 په پرتله ښودل شوې. د SEM سره د څرګندولو نمونه ښودل شوې (n = 6 صحي بسپنه ورکوونکي). د Ct ارزښتونه چې له 35 څخه ډیر وي د کشف وړ نه ګڼل کیږي (UD). (F) د SK-OV-3، HEK293T، T حجرو او د 8mM MNA سره درملنه شوي T حجرو کې د SLC22A1 او SLC22A2 څرګندونه. پوښل شوی څرګندونه د SK-OV-3 په پرتله ښودل شوې. د SEM سره د څرګندولو نمونه ښودل شوې (n = 6 صحي بسپنه ورکوونکي). د 35 څخه ډیر د Ct ارزښتونه د کشف وړ نه ګڼل کیږي (UD). (G) د MNA سره د 72 ساعتونو انکیوبیشن وروسته په فعال شوي صحي بسپنه ورکوونکي T حجرو کې د حجرو MNA مینځپانګه. د SEM سره د څرګندولو نمونه ښودل شوې (n = 4 صحي بسپنه ورکوونکي).
MNA د نیکوتینامایډ N-methyltransferase (NNMT؛ شکل 3B) لخوا د S-adenosyl-1-methionine (SAM) څخه نیکوتینامایډ (NA) ته د میتیل ګروپ لیږدولو سره تولید کیږي. NNMT د انسانانو په مختلفو سرطانونو کې ډیر څرګندیږي او د تکثیر، یرغل او میټاسټاسیس سره تړاو لري (25-27). په TME کې د T حجرو کې د MNA سرچینې ښه پوهیدو لپاره، موږ د HGSC دریو ناروغانو د اسایټونو او تومورونو کې د حجرو ډولونو کې د NNMT څرګندولو ځانګړتیا لپاره scRNA-seq وکاروو (جدول S5). د نږدې 6,500 حجرو تحلیل ښودلې چې په اسایټونو او تومور چاپیریال کې، د NNMT څرګندونه د فرض شوي فایبروبلاست او تومور حجرو نفوس پورې محدوده وه (شکل 3، C او D). دا د یادونې وړ ده چې په هیڅ نفوس کې د NNMT څرګندونه شتون نلري چې PTPRC (CD45 +) څرګندوي (شکل 3D او شکل S5A)، کوم چې دا په ګوته کوي چې د میټابولایټ سپیکٹرم کې کشف شوی MNA په T حجرو کې معرفي شوی. د الډی هایډ اکسیډیز 1 (AOX1) څرګندونه MNA په 1-میتیل-2-پیریډون-5-کاربوکسامایډ (2-PYR) یا 1-میتیل-4-پیریډون-5-کاربوکسامایډ (4- PYR) بدلوي؛ شکل 3B) د فایبروبلاستونو نفوس پورې هم محدود دی چې COL1A1 څرګندوي (شکل S5A)، کوم چې په ګډه دا په ګوته کوي چې د T حجرې د دودیز MNA میټابولیزم وړتیا نلري. د دې MNA پورې اړوند جینونو د څرګندولو نمونه د HGSC ناروغانو څخه د اسایټونو څخه د دوهم خپلواک حجرو ډیټا سیټ په کارولو سره تایید شوې (شکل S5B؛ n = 6) (16). برسېره پردې، د MNA سره درملنه شوي صحي ډونر T حجرو د کمیتي پولیمریز چین عکس العمل (qPCR) تحلیل ښودلې چې د کنټرول SK-OV-3 تخمدان تومور حجرو سره پرتله کول، NNMT یا AOX1 تقریبا څرګند نه و (شکل 3E). دا غیر متوقع پایلې ښیي چې MNA ممکن د فایبروبلاستونو یا تومورونو څخه په TME کې نږدې T حجرو ته پټ شي.
که څه هم نوماندان د عضوي کیشن لیږدونکو 1 څخه تر 3 پورې کورنۍ (OCT1، OCT2 او OCT3) شامل دي چې د محلول وړونکي 22 (SLC22) کورنۍ (SLC22A1، SLC22A2 او SLC22A3) لخوا کوډ شوي، د MNA احتمالي لیږدونکي لاهم نا تعریف شوي دي (28). د صحي ډونر T حجرو څخه د mRNA QPCR د SLC22A1 ټیټ څرګندونه کچه ښودلې مګر د SLC22A2 نه کشف کیدونکي کچه، کوم چې تاییدوي چې دا دمخه په ادب کې راپور شوی و (شکل 3F) (29). برعکس، د SK-OV-3 د تخمدان د تومور حجرو لاین د دواړو لیږدونکو لوړه کچه څرګنده کړه (شکل 3F).
د دې لپاره چې د T حجرو د بهرني MNA د جذبولو وړتیا د امکان ازموینه وشي، صحي ډونر T حجرې د MNA د مختلفو غلظتونو په شتون کې د 72 ساعتونو لپاره کلچر شوي. د خارجي MNA په نشتوالي کې، د MNA حجروي مینځپانګه نشي کشف کیدی (شکل 3G). په هرصورت، د خارجي MNA سره درملنه شوي فعال T حجرو په حجرو کې د MNA مینځپانګې کې د خوراک پورې تړلي زیاتوالی ښودلی، تر 6 mM MNA پورې (شکل 3G). دا پایله ښیي چې د ټرانسپورټر څرګندونې ټیټې کچې او د داخلي MNA میټابولیزم لپاره مسؤل اصلي انزایم نشتوالي سره سره، TIL لاهم کولی شي MNA ونیسي.
د ناروغانو د T حجرو او د ان ویټرو MNA جذب تجربو کې د میټابولایټونو طیف دا امکان زیاتوي چې د سرطان سره تړلي فایبروبلاستونه (CAF) MNA خپروي او د تومور حجرې ممکن د TIL فینوټایپ او فعالیت تنظیم کړي. د T حجرو باندې د MNA اغیزې ټاکلو لپاره، د MNA په شتون یا نشتوالي کې صحي ډونر T حجرې په ویټرو کې فعالې شوې، او د دوی تکثیر او سایټوکین تولید ارزول شوی. د MNA په لوړ دوز کې د 7 ورځو اضافه کولو وروسته، د نفوس دوه چنده شمیره په اعتدال ډول کمه شوه، پداسې حال کې چې په ټولو دوزونو کې ځواک ساتل شوی و (شکل 4A). سربیره پردې، د خارجي MNA درملنې پایله د CD4 + او CD8 + T حجرو تناسب کې زیاتوالی رامینځته کړ چې د تومور نیکروسس فکتور-α څرګندوي (TNFα؛ شکل 4B). برعکس، د IFN-γ د انټرا سیلولر تولید په CD4 + T حجرو کې د پام وړ کم شوی و، مګر په CD8 + T حجرو کې نه، او په انټرلیوکین 2 کې د پام وړ بدلون نه و (IL-2؛ شکل 4، C او D). له همدې امله، د دې MNA-درملنې شوي T حجرو کلتورونو څخه د سپرناټینټونو انزایم سره تړلي معافیتي ازموینې (ELISA) په TNFα کې د پام وړ زیاتوالی، په IFN-γ کې کمښت، او په IL-2 کې هیڅ بدلون نه دی ښودلی (شکل 4، E څخه G). . د IFN-γ کمښت ښیي چې MNA ممکن د T حجرو د تومور ضد فعالیت په مخنیوي کې رول ولوبوي. د T حجرو په منځګړیتوب سایټوټوکسیکیت باندې د MNA اغیزې تقلید کولو لپاره، د کایمیریک انټيجن ریسیپټر T (FRα-CAR-T) حجرې چې د فولیټ ریسیپټر α او CAR-T (GFP) په نښه کوي چې د شنه فلوروسینټ پروټین (GFP) -CAR-T) حجرو لخوا تنظیم شوي د صحي ډونر پیریفیریل وینې مونونیوکلیر حجرو (PBMC) لخوا تولید کیږي. د CAR-T حجرې د MNA په شتون کې د 24 ساعتونو لپاره کلتور شوي، او بیا د انسان SK-OV-3 تخمدان تومور حجرو سره ګډ کلتور شوي چې د فولیټ ریسیپټر α د 10:1 په اغیزمن تناسب کې څرګندوي. د MNA درملنې د FRα-CAR-T حجرو د وژنې فعالیت کې د پام وړ کمښت لامل شو، کوم چې د اډینوسین سره درملنه شوي FRα-CAR-T حجرو ته ورته و (شکل 4H).
(الف) د حجرو ټول فعال شمېر او د نفوس دوه چنده کول (PD) په مستقیم ډول د ورځې په اوومه کې د کلتور څخه. د بار ګراف د شپږو صحي بسپنه ورکوونکو اوسط + SEM استازیتوب کوي. د لږترلږه n = 3 خپلواکو تجربو څخه معلومات استازیتوب کوي. (B څخه تر D پورې) CD3/CD28 او IL-2 د 7 ورځو لپاره د دوی اړوند MNA غلظت کې د T حجرو فعالولو لپاره کارول شوي. د تحلیل دمخه، حجرې د 4 ساعتونو لپاره د GolgiStop سره د PMA/ionomycin سره هڅول شوي. په T حجرو کې TNFα (B) څرګندونه. د مثال انځور (کیڼ اړخ) او په ژوندیو حجرو کې د TNFα څرګندولو جدول (ښي اړخ). په T حجرو کې IFN-γ (C) او IL-2 (D) څرګندونه. د سایټوکینونو څرګندونه د جریان سایټومیټري لخوا اندازه شوې. د بار ګراف د اوسط (n = 6 صحي بسپنه ورکوونکي) + SEM استازیتوب کوي. د P ارزښت ټاکلو لپاره د تغیر او تکرار اقداماتو یو اړخیز تحلیل (*P<0.05 او **P<0.01) وکاروئ. لږترلږه n = 3 خپلواکو تجربو څخه معلومات استازیتوب کوي. (E څخه G ته) CD3/CD28 او IL-2 د 7 ورځو لپاره د دوی په اړوند MNA غلظت کې د T حجرو فعالولو لپاره کارول شوي. دا منځنی د PMA/ionomycin محرک څخه 4 ساعته مخکې او وروسته راټول شوی و. د TNFα (E)، IFN-γ (F) او IL-2 (G) غلظت د ELISA لخوا اندازه شوی. د بار ګراف د اوسط (n = 5 صحي بسپنه ورکوونکي) + SEM استازیتوب کوي. د P ارزښت د تغیر او تکرار اندازه کولو یو اړخیز تحلیل په کارولو سره ټاکل شوی (*P<0.05). نقطه شوی کرښه د کشف د کشف حد په ګوته کوي. (H) د حجرو د تحلیل ارزونه. FRα-CAR-T یا GFP-CAR-T حجرې د 24 ساعتونو لپاره د اډینوسین (250μM) یا MNA (10 mM) سره تنظیم شوي، یا بې درملنې پاتې شوي (Ctrl). د SK-OV-3 حجرو د وژنې سلنه اندازه شوې. د P ارزښت د ویلچ t ازموینې (*P<0.5 او **P<0.01) لخوا ټاکل شوی.
د MNA پورې تړلي TNFα د څرګندولو تنظیم کولو میکانیزم پوهیدو لپاره، د MNA درملنې شوي T حجرو TNFα mRNA کې بدلونونه ارزول شوي (شکل 5A). د MNA سره درملنه شوي صحي ډونر T حجرو د TNFα د لیږد کچې کې دوه چنده زیاتوالی ښودلی، چې دا په ګوته کوي چې MNA د TNFα د لیږد تنظیم پورې اړه لري. د دې ممکنه تنظیمي میکانیزم د څیړلو لپاره، دوه پیژندل شوي لیږد عوامل چې TNFα تنظیموي، د فعال شوي T حجرو اټومي فاکتور (NFAT) او ځانګړي پروټین 1 (Sp1)، د نږدې TNFα پروموټر سره د MNA تړلو په ځواب کې ارزول شوي (30). د TNFα پروموټر 6 پیژندل شوي NFAT تړلو سایټونه او 2 Sp1 تړلو سایټونه لري، په یوه سایټ کې سره یوځای کیږي [-55 اساس جوړې (bp) د 5'cap څخه] (30). د کروماتین معافیت معافیت (ChIP) ښودلې چې کله د MNA سره درملنه وشوه، د TNFα پروموټر سره د Sp1 تړل درې چنده زیات شو. د NFAT شاملول هم زیات شول او اهمیت ته نږدې شول (شکل 5B). دا معلومات ښیي چې MNA د Sp1 ټرانسکرپشن له لارې د TNFα څرګندونه تنظیموي، او تر یوې اندازې پورې د NFAT څرګندونه.
(الف) د MNA پرته د کرل شوي T حجرو سره پرتله کول، د MNA سره درملنه شوي T حجرو کې د TNFα څرګندولو فولډ بدلون. د SEM سره د څرګندولو نمونه ښودل شوې (n = 5 صحي بسپنه ورکوونکي). د لږترلږه n = 3 خپلواکو تجربو څخه معلومات استازیتوب کوي. (ب) د NFAT او Sp1 وروسته د 8 mM MNA سره یا پرته د T حجرو TNFα پروموټر د (Ctrl) او PMA/ionomycin محرک سره د 4 ساعتونو لپاره یوځای شوي. امیونوګلوبولین G (IgG) او H3 په ترتیب سره د معافیت لپاره د منفي او مثبت کنټرولونو په توګه کارول شوي. د ChIP اندازه کول وښودله چې د MNA درملنې شوي حجرو کې د TNFα پروموټر سره د Sp1 او NFAT تړل د کنټرول په پرتله څو ځله زیات شوي. د لږترلږه n = 3 خپلواکو تجربو څخه معلومات استازیتوب کوي. د P ارزښت د ډیری t-ټیسټونو لخوا ټاکل شوی (*** P <0.01). (ج) د HGSC د اسایټونو په پرتله، د T حجرو (غیر سایټوټوکسیک) په تومور کې د TNF څرګندونه زیاته کړې. رنګونه د مختلفو ناروغانو استازیتوب کوي. ښودل شوي حجرات په ناڅاپي ډول 300 ته نمونې شوي او د ډیر ډراوینګ محدودولو لپاره جټ شوي دي (** Padj = 0.0076). (D) د تخمدان د سرطان لپاره د MNA وړاندیز شوی ماډل. MNA په TME کې د تومور حجرو او فایبروبلاستونو کې تولید کیږي او د T حجرو لخوا اخیستل کیږي. MNA د TNFα پروموټر سره د Sp1 تړل زیاتوي، چې د TNFα لیږد او TNFα سایټوکین تولید زیاتوي. MNA د IFN-γ کمښت هم رامینځته کوي. د T حجرو فعالیت مخنیوی د وژنې وړتیا کمولو او د تومور وده ګړندۍ کولو لامل کیږي.
د راپورونو له مخې، TNFα د مخ او شا پورې تړلي د تومور ضد او د تومور ضد اغیزې لري، مګر دا د تخمدان د سرطان د ودې او میټاسټاسیس په هڅولو کې یو مشهور رول لري (31-33). د راپورونو له مخې، د تخمدان د سرطان ناروغانو کې د اسایټ او تومور نسجونو کې د TNFα غلظت د نرم نسجونو په پرتله لوړ دی (34-36). د میکانیزم له مخې، TNFα کولی شي د سپینې وینې حجرو فعالول، فعالیت او تکثیر تنظیم کړي، او د سرطان حجرو فینوټایپ بدل کړي (37، 38). د دې موندنو سره سم، د جین د توپیر څرګندولو تحلیل ښودلې چې TNF د اسایټ په پرتله د تومور نسجونو کې د T حجرو کې د پام وړ لوړ تنظیم شوی و (شکل 5C). د TNF څرګندولو زیاتوالی یوازې د T حجرو نفوس کې د غیر سایټوټوکسیک فینوټایپ (شکل S5A) سره څرګند و. په لنډیز کې، دا معلومات د دې نظر ملاتړ کوي چې MNA په HGSC کې دوه ګونی معافیت ضد او د تومور هڅونکي اغیزې لري.
د فلو سایټومیټري پر بنسټ د فلوروسینټ لیبل کول د TIL میټابولیزم مطالعې لپاره اصلي میتود ګرځیدلی. دې مطالعاتو ښودلې چې د ثانوي لیمفاید ارګانونو څخه د پردیو وینې لیمفوسایټس یا T حجرو سره پرتله کول، مورین او د انسان TIL د ګلوکوز اخیستلو لپاره لوړ تمایل لري (4، 39) او د مایټوکونډریال فعالیت تدریجي ضایع (19، 40). که څه هم موږ پدې څیړنه کې ورته پایلې لیدلي دي، کلیدي پرمختګ د ورته ریسیک شوي تومور نسج څخه د تومور حجرو او TIL میټابولیزم پرتله کول دي. د دې پخوانیو راپورونو سره سم، د اسایټس او تومورونو څخه د تومور (CD45-EpCAM +) حجرې د CD8 + او CD4 + T حجرو په پرتله لوړ ګلوکوز جذب لري، چې دا ملاتړ کوي چې د تومور حجرو لوړ ګلوکوز جذب د T حجرو سره پرتله کیدی شي. د T حجرو سیالۍ مفهوم. TME. په هرصورت، د تومور حجرو د مایټوکونډریال فعالیت د CD8 + T حجرو په پرتله لوړ دی، مګر د مایټوکونډریال فعالیت د CD4 + T حجرو سره ورته دی. دا پایلې د راپورته کیدونکي موضوع تقویه کوي چې اکسیډیټیو میټابولیزم د تومور حجرو لپاره مهم دی (41، 42). دوی دا هم وړاندیز کوي چې د CD8 + T حجرات ممکن د CD4 + T حجراتو په پرتله د اکسیډیټیو اختلال لپاره ډیر حساس وي، یا دا چې CD4 + T حجرات ممکن د ګلوکوز پرته د کاربن سرچینې وکاروي ترڅو د مایټوکونډریال فعالیت وساتي (43، 44). دا باید په یاد ولرئ چې موږ د CD4 + T اغیز کونکو، T اغیز کونکو حافظې او په اسایټونو کې د T مرکزي حافظې حجرو ترمنځ د ګلوکوز جذب یا مایټوکونډریال فعالیت کې هیڅ توپیر ونه لید. په ورته ډول، په تومورونو کې د CD8 + T حجرو د توپیر حالت د ګلوکوز جذب کې بدلونونو سره هیڅ تړاو نلري، چې د T حجرو ترمنځ د پام وړ توپیر په ویټرو کې کلتور شوی او په ویوو کې د انسان TIL ترمنځ روښانه کوي (22). دا مشاهدې د بې طرفه اتوماتیک حجرو نفوس تخصیص کارولو لخوا هم تایید شوې، کوم چې نور یې څرګنده کړه چې د CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + حجرات د تومور حجرو په پرتله د ګلوکوز جذب او مایټوکونډریال فعالیت سره شتون لري مګر د میټابولیک فعال حجرو نفوس لري. دا نفوس ممکن د scRNA-seq تحلیل کې پیژندل شوي د مایلایډ سپریسر حجرو یا پلازما سایټایډ ډینډریټیک حجرو احتمالي فرعي نفوس استازیتوب وکړي. که څه هم دا دواړه د انسان د تخمدان په تومورونو کې راپور شوي دي [45]، دوی لاهم اړتیا لري چې د دې مایلایډ فرعي نفوس تشریح کولو لپاره نور کار وشي.
که څه هم د جریان سایټومیټري پر بنسټ میتودونه کولی شي د حجرو ډولونو ترمنځ د ګلوکوز او اکسیډیټیو میټابولیزم عمومي توپیرونه روښانه کړي، په TME کې د مایټوکونډریال میټابولیزم لپاره د ګلوکوز یا نورو کاربن سرچینو لخوا تولید شوي دقیق میټابولیتونه لا تر اوسه ندي ټاکل شوي. د ورکړل شوي TIL فرعي سیټ ته د میټابولیتونو شتون یا نه شتون ټاکل د حجرو نفوس پاکولو ته اړتیا لري. له همدې امله، زموږ د حجرو غني کولو میتود د ډله ایز سپیکٹرومیټري سره یوځای کولی شي د میټابولیتونو په اړه بصیرت چمتو کړي چې د T حجرو او د تومور حجرو نفوس کې د ناروغانو نمونو سره په مطابقت کې په توپیر سره بډایه شوي دي. که څه هم دا میتود د فلوروسینس فعال شوي حجرو ترتیب کولو په پرتله ګټې لري، ځینې میټابولیت کتابتونونه ممکن د موروثي ثبات او/یا د چټک بدلون نرخ له امله اغیزمن شي (22). سره له دې، زموږ میتود وکولی شو دوه پیژندل شوي معافیتي فشارونکي میټابولیتونه، اډینوسین او کینورینین وپیژني، ځکه چې دوی د نمونې ډولونو ترمنځ خورا توپیر لري.
زموږ د تومورونو او TIL فرعي ډولونو میټابونومیک تحلیل د تخمدان TME کې د میټابولایټونو رول په اړه ډیر بصیرت چمتو کوي. لومړی، د جریان سایټومیټري په کارولو سره، موږ معلومه کړه چې د تومورونو او CD4 + T حجرو ترمنځ د مایټوکونډریال فعالیت کې هیڅ توپیر شتون نلري. په هرصورت، د LC-MS/MS تحلیل د دې نفوسو ترمنځ د میټابولایټونو په کثرت کې د پام وړ بدلونونه څرګند کړل، چې دا په ګوته کوي چې د TIL میټابولیزم او د هغې ټول میټابولیک فعالیت په اړه پایلې محتاط تفسیر ته اړتیا لري. دوهم، MNA هغه میټابولایټ دی چې د CD45 حجرو او T حجرو ترمنځ په اسایټونو کې ترټولو لوی توپیر لري، نه تومورونه. له همدې امله، د تومورونو جلا کول او موقعیت ممکن د TIL میټابولیزم باندې مختلف اغیزې ولري، کوم چې په ورکړل شوي مایکرو چاپیریال کې احتمالي متضادیت روښانه کوي. دریم، د MNA تولیدونکي انزایم NNMT څرګندونه په عمده توګه CAF پورې محدوده ده، کوم چې په لږ حد کې د تومور حجرې دي، مګر د کشف وړ MNA کچه د تومور څخه اخیستل شوي T حجرو کې لیدل کیږي. د تخمدان CAF کې د NNMT ډیر څرګندونه د سرطان هڅولو پیژندل شوی اغیزه لري، چې په جزوي ډول د CAF میټابولیزم، د تومور یرغل او میټاسټاسیس (27) د ودې له امله ده. که څه هم د TIL عمومي کچه معتدله ده، په CAF کې د NNMT څرګندونه د سرطان جینوم اتلس (TCGA) میسنچیمال فرعي ډول سره نږدې تړاو لري، کوم چې د ضعیف تشخیص سره تړاو لري (27، 46، 47). په پای کې، د MNA تخریب لپاره مسؤل انزایم AOX1 څرګندونه هم د CAF نفوس پورې محدوده ده، کوم چې دا په ګوته کوي چې د T حجرې د MNA میټابولیز کولو وړتیا نلري. دا پایلې د دې نظر ملاتړ کوي چې که څه هم د دې موندنې تصدیق کولو لپاره نور کار ته اړتیا ده، په T حجرو کې د MNA لوړه کچه ممکن د معافیت ضد CAF مایکرو چاپیریال شتون په ګوته کړي.
د MNA لیږدونکو د ټیټې څرګندې کچې او د MNA میټابولیزم کې د ښکیلو کلیدي پروټینونو د نه کشف کیدونکي کچې په پام کې نیولو سره، په T حجرو کې د MNA شتون غیر متوقع دی. نه NNMT او نه هم AOX1 د scRNA-seq تحلیل او د دوه خپلواکو ډلو د هدف شوي qPCR لخوا کشف کیدی شي. دا پایلې ښیې چې MNA د T حجرو لخوا ترکیب شوی نه دی، مګر د شاوخوا TME څخه جذب شوی. د ویټرو تجربو ښیې چې د T حجرو تمایل لري چې خارجي MNA راټول کړي.
زموږ د ان ویټرو مطالعاتو ښودلې چې خارجي MNA د T حجرو کې د TNFα څرګندونه هڅوي او د TNFα پروموټر سره د Sp1 تړل زیاتوي. که څه هم TNFα د تومور ضد او د تومور ضد دندې لري، د تخمدان سرطان کې، TNFα کولی شي د تخمدان سرطان وده ته وده ورکړي (31-33). د تخمدان د تومور حجرو کلتور کې د TNFα بې طرفه کول یا د موږک ماډلونو کې د TNFα سیګنال له مینځه وړل کولی شي د TNFα منځګړیتوب التهابي سایټوکین تولید ښه کړي او د تومور وده منع کړي (32، 35). له همدې امله، پدې حالت کې، د TME څخه اخیستل شوی MNA کولی شي د آټوکرین لوپ له لارې د TNFα پورې تړلي میکانیزم له لارې د التهابي پرو میټابولایټ په توګه عمل وکړي، په دې توګه د تخمدان د سرطان پیښې او خپریدو ته وده ورکوي (31). د دې امکان پراساس، د TNFα بندیدل د تخمدان د سرطان لپاره د احتمالي درملنې اجنټ په توګه مطالعه کیږي (37، 48، 49). سربیره پردې، MNA د تخمدان د تومور حجرو ته د CAR-T حجرو سایټوټوکسیکیت خرابوي، د MNA منځګړیتوب معافیت فشار لپاره نور شواهد چمتو کوي. په ټولیز ډول، دا پایلې یو ماډل وړاندیز کوي چې پکې تومورونه او CAF حجرې MNA د حجرو څخه بهر TME ته پټوي. د (i) د TNF- هڅول شوي تخمدان سرطان ودې محرک او (ii) د MNA هڅول شوي T حجرو سایټوټوکسیک فعالیت مخنیوی له لارې، دا ممکن دوه ګونی تومور اغیز ولري (شکل 5D).
په پایله کې، د چټک حجرو غني کولو، د واحد حجرو ترتیب او میټابولیک پروفایل کولو ترکیب په کارولو سره، دې مطالعې د HGSC ناروغانو کې د تومورونو او اسایټ حجرو ترمنځ لوی معافیتي میټابولومیک توپیرونه څرګند کړل. دې جامع تحلیل وښودله چې د T حجرو ترمنځ د ګلوکوز جذب او مایټوکونډریال فعالیت کې توپیرونه شتون لري، او MNA د غیر حجروي خودمختار معافیت تنظیم کونکي میټابولایټ په توګه پیژندل شوی. دا معلومات پدې اغیزه لري چې TME څنګه د انسان سرطان کې د T حجرو میټابولیزم اغیزه کوي. که څه هم د T حجرو او سرطان حجرو ترمنځ د مغذي موادو لپاره مستقیم سیالي راپور شوې، میټابولایټونه کولی شي د غیر مستقیم تنظیم کونکو په توګه هم عمل وکړي ترڅو د تومور پرمختګ ته وده ورکړي او ممکن د داخلي معافیت غبرګونونه فشار کړي. د دې تنظیمي میټابولایټونو د فعال رول نور توضیحات ممکن د تومور ضد معافیت غبرګون لوړولو لپاره بدیل ستراتیژۍ پرانیزي.
د ناروغانو نمونې او کلینیکي معلومات د کاناډا د نسجونو د ذخیره کولو شبکې لخوا تصدیق شوي د BC سرطان د تومور نسجونو د ذخیره کولو له لارې ترلاسه شوي. د BC سرطان د څیړنې اخلاقو کمیټې او د برتانوي کولمبیا پوهنتون (H07-00463) لخوا تصویب شوي پروتوکول سره سم، د ټولو ناروغانو نمونې او کلینیکي معلومات باخبره لیکلي رضایت ترلاسه کړی یا په رسمي ډول د دوی رضایت څخه معاف شوي. نمونې په تصدیق شوي بایو بانک (BRC-00290) کې زیرمه شوي. د ناروغ تفصيلي ځانګړتیاوې په جدولونو S1 او S5 کې ښودل شوي. د کریوپریزرویشن لپاره، یو سکالپل کارول کیږي ترڅو د ناروغ د تومور نمونه په میخانیکي ډول تجزیه کړي او بیا یې د 100 مایکرون فلټر له لارې فشار ورکړي ترڅو یو واحد حجروي تعلیق ترلاسه کړي. د ناروغ اسایټونه په 1500 rpm کې د 10 دقیقو لپاره په 4°C کې سینټرفیوج شوي ترڅو حجرې ګولۍ کړي او سپرنټینټ لرې کړي. د تومور او اسایټ څخه ترلاسه شوي حجرات په 50٪ تودوخې غیر فعال شوي انساني AB سیرم (سیګما-الډریچ)، 40٪ RPMI-1640 (ترمو فشر ساینسيف) او 10٪ ډایمیتیل سلفوکسایډ کې کریوپریزر شوي وو. دا ساتل شوي واحد حجروي تعلیقونه ویلې شوي وو او د میټابولومیکونو او میټابولایټ ټاکلو لپاره کارول شوي وو چې لاندې تشریح شوي.
بشپړ منځنی برخه د 0.22 μm فلټر شوي 50:50 ضمیمه شوي RPMI 1640 څخه جوړه ده: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) د 10٪ تودوخې غیر فعال شوي انساني AB سیرم (Sigma-Aldrich)، 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific)، 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific)، 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) محلول (Thermo Fisher Scientific) او 50 μMB-mercaptoethanol سره ضمیمه شوی. AimV (Invitrogen) د 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) او 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) سره ضمیمه شوی. د جریان سایټومیټر سټینینګ بفر د 0.22 μm فلټر شوي فاسفیټ بفر شوي مالګین (PBS؛ Invitrogen) څخه جوړ شوی چې د 3٪ تودوخې غیر فعال شوي AB انساني سیرم (Sigma) سره ضمیمه شوی. د حجرو د غني کولو بفر د 0.22μm فلټر شوي PBS څخه جوړ شوی او د 0.5٪ تودوخې غیر فعال شوي انساني AB سیرم (سیګما-الډریچ) سره ضمیمه شوی.
په ۳۷ درجو سانتي ګراد بشپړ منځني تودوخه کې، حجرې د ۱۰ nM MT DR او ۱۰۰ μM ۲-NBDG سره د ۳۰ دقیقو لپاره رنګ شوي وو. بیا، حجرې د وایبیلټي ډای eF506 سره د ۴ درجو سانتي ګراد په ۱۵ دقیقو کې رنګ شوي وو. حجرې په FC بلاک (eBioscience) او Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) کې بیا وځنډوئ، د فلو سایټومیټر سټینینګ بفر کې منحل کړئ (د جوړونکي لارښوونو سره سم)، او د خونې په تودوخه کې د ۱۰ دقیقو لپاره انکیوبیټ کړئ. حجرې د انټي باډیز (جدول S2) سیټ سره د فلو سایټومیټر سټینینګ بفر کې د ۲۰ دقیقو لپاره په ۴ درجو سانتي ګراد کې رنګ کړئ. حجرې د تحلیل دمخه د فلو سایټومیټر سټینینګ بفر (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R ترتیب) کې بیا وځنډوئ. د حجرو د شمیرې معلوماتو تحلیل لپاره SpectroFlo او FlowJo V10 وکاروئ، او د معلوماتو جوړولو لپاره GraphPad Prism 8 وکاروئ. د 2-NBDG او MT DR د منځنۍ فلوروسینس شدت (MFI) لاګ-نورمال شوی و، او بیا د احصایوي تحلیل لپاره د مطابقت لرونکو ناروغانو حساب ورکولو لپاره جوړه شوې t ازموینه کارول شوې وه. له تحلیل څخه ټول نفوس لرې کړئ چې له 40 څخه کم پیښې لري؛ د احصایوي تحلیل او معلوماتو لید ترسره کولو دمخه د هر منفي ارزښتونو لپاره د 1 MFI ارزښت دننه کړئ.
د پورته پروسې پینل د لاسي ګیټینګ ستراتیژۍ د بشپړولو لپاره، موږ د شکل محدودیت ونې (FAUST) (21) لخوا بشپړ تشریح وکاروو ترڅو په اتوماتيک ډول حجرې په FlowJo کې د مړو حجرو له مینځه وړلو وروسته نفوس ته وټاکو. موږ په لاسي ډول محصول اداره کوو ترڅو هغه نفوس سره یوځای کړو چې داسې ښکاري چې غلط تخصیص شوي وي (PD1+ د PD1-تومور حجرو سره یوځای کول) او ساتل شوي نفوس. هره نمونه په اوسط ډول د 2٪ څخه ډیر حجرې لري، د ټولټال 11 نفوس لپاره.
د فیکول ګریډینټ کثافت سنټرفیوګیشن د PBMC د لیوکوسایټ جلا کولو محصولاتو (STEMCELL ټیکنالوژۍ) څخه جلا کولو لپاره کارول شوی و. CD8 + T حجرې د CD8 مایکروبیډز (ملټیني) په کارولو سره د PBMC څخه جلا شوې او د تولید کونکي لارښوونو سره سم د 2 اونیو لپاره د TransAct (ملټیني) په کارولو سره په بشپړ میډیم کې پراخه شوې. حجرو ته اجازه ورکړل شوې وه چې د IL-7 (10 ng/ml؛ PeproTech) لرونکي بشپړ میډیم کې د 5 ورځو لپاره ودریږي، او بیا د TransAct سره بیا هڅول کیږي. په 7مه ورځ، د تولید کونکي لارښوونو سره سم، د انسان CD45 مایکروبیډز (ملټیني) د دریو پرله پسې پړاوونو کې د حجرو بډایه کولو لپاره کارول شوي. حجرې د جریان سایټومیټري تحلیل لپاره جلا شوې وې (لکه څنګه چې پورته تشریح شوې)، او یو ملیون حجرې د LC-MS/MS تحلیل لپاره درې ځله جلا شوې وې. نمونې د LC-MS/MS لخوا پروسس شوې لکه څنګه چې لاندې تشریح شوې. موږ د ورک شوي میټابولایټ ارزښت د 1,000 د ایون شمیر سره اټکل کړ. هره نمونه د ټول ایون شمیر (TIC) لخوا نورمال کیږي، په لوګاریتمیک ډول بدلیږي او د تحلیل دمخه په میټابو انالیسټر کې په اتوماتيک ډول نورمال کیږي.
د هر ناروغ د واحد حجروي تعلیق د 40 μm فلټر له لارې په بشپړ میډیم کې غوړول شوی او فلټر شوی و (لکه څنګه چې پورته تشریح شوی). د جوړونکي پروتوکول سره سم، د مایکروبیډز (ملټیني) په کارولو سره د مقناطیسي مڼو جلا کولو له لارې د مثبت انتخاب درې پرله پسې پړاوونه د CD8+، CD4+ او CD45- حجرو لپاره نمونې (په یخ باندې) بډایه کولو لپاره کارول شوي. په لنډه توګه، حجرې د حجرو بډایه کولو بفر کې بیا ځنډول شوي (لکه څنګه چې پورته تشریح شوی) او شمیرل شوي. حجرې د 15 دقیقو لپاره په 4 درجو سانتي ګراد کې د انسان CD8 مڼو، انساني CD4 مڼو یا انساني CD45 مڼو (ملټیني) سره انکیوب شوي، او بیا د حجرو بډایه کولو بفر سره مینځل شوي. نمونه د LS کالم (ملټیني) له لارې تیریږي، او مثبت او منفي کسرونه راټول شوي. د مودې کمولو او د حجرو د بیا رغونې مرحلې اعظمي کولو لپاره، بیا د CD8- کسر د CD4+ بډایه کولو دوهم پړاو لپاره کارول کیږي، او د CD4- کسر د راتلونکي CD45- بډایه کولو لپاره کارول کیږي. محلول د جلا کولو پروسې په اوږدو کې په یخ کې وساتئ.
د میټابولایټ تحلیل لپاره نمونې چمتو کولو لپاره، حجرې یو ځل د یخ یخ مالګې محلول سره ومینځل شوې، او په هر نمونې کې د 80٪ میتانول 1 ملی لیتر اضافه شو، بیا وورټیکس شو او په مایع نایتروجن کې یخ شو. نمونې د کنګل کولو او ویلو درې دورې سره مخ شوې او په 14,000 rpm کې د 15 دقیقو لپاره په 4 درجو سانتیګراد کې سینټرفیوج شوې. هغه سوپرنټینټ چې میټابولایټونه لري تر هغه وخته پورې تبخیر کیږي چې وچ شي. میټابولایټونه د 0.03٪ فارمیک اسید په 50 μl کې بیا منحل شوي، د مخلوط کولو لپاره وورټیکس شوي، او بیا د کثافاتو لرې کولو لپاره سینټرفیوج شوي.
لکه څنګه چې پورته تشریح شوي میټابولایټونه استخراج کړئ. د میټابولومیک څیړنې لپاره سوپرنټینټ د لوړ فعالیت مایع کروماتګرافي بوتل ته انتقال کړئ. د هرې نمونې د ورته شمیر حجرو سره د درملنې لپاره د تصادفي درملنې پروتوکول وکاروئ ترڅو د بیچ اغیزو مخه ونیسئ. موږ د نړیوال میټابولایټونو کیفیتي ارزونه ترسره کړه چې دمخه په AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) کې خپره شوې وه. د کروماتګرافیک تحلیل او د چوکۍ ساحې ادغام د ملټي کوانټ نسخه 2.1 سافټویر (Applied Biosystems SCIEX) په کارولو سره ترسره شو.
د ورک شوي میټابولایټ ارزښت اټکل کولو لپاره د 1000 ایون شمیره کارول شوې وه، او د هرې نمونې TIC د نمونې پروسس کولو څخه د وسیلې تحلیل لخوا معرفي شوي بدلونونو سمولو لپاره د هر کشف شوي میټابولایټ د نورمال شوي چوکۍ ساحې محاسبه کولو لپاره کارول شوی و. وروسته له دې چې TIC نورمال شي، MetaboAnalystR(51) (ډیفالټ پیرامیټر) د لوګاریتمیک تبادلې او اتوماتیک نورم لاین سکیلینګ لپاره کارول کیږي. موږ د نمونې ډولونو ترمنځ د میټابولوم توپیرونو سپړنې تحلیل ترسره کولو لپاره د ویګن R پیکج سره PCA کارولی، او د ناروغانو تحلیل لپاره د جزوي بې ځایه کیدو تحلیل کارولی. د نمونو ترمنځ د یوکلیډین فاصلې کلستر کولو لپاره د تودوخې نقشه ډینډروګرام جوړولو لپاره د وارډ میتود وکاروئ. موږ د معیاري میټابولایټ کثرت په اړه لیما (52) کارولی ترڅو د ټول حجرو ډول او مایکرو چاپیریال کې په توپیر سره ډیر میټابولایټونه وپیژنو. د وضاحت ساده کولو لپاره، موږ د ماډل مشخص کولو لپاره د ګروپ اوسط پیرامیټر کاروو، او په مایکرو چاپیریال کې د حجرو ډولونه د هر ګروپ په توګه په پام کې نیسو (n = 6 ګروپونه)؛ د اهمیت ازموینې لپاره، موږ د هر میټابولایټ لپاره درې تکراري اندازه ګیرۍ ترسره کړې. د غلط نقل څخه د مخنیوي لپاره، ناروغ د لیما ډیزاین کې د خنډ په توګه شامل شو. د مختلفو ناروغانو ترمنځ د میټابولایټونو توپیرونو د چک کولو لپاره، موږ د لیما ماډل په ثابت ډول د ناروغانو په ګډون تنظیم کړ. موږ د حجرو ډول او د پادج <0.05 (بنیامیني-هچبرګ سمون) د مایکرو چاپیریال ترمنځ د مخکې ټاکل شوي توپیر اهمیت راپور ورکوو.
د ملټیني د مړو حجرو د لرې کولو کټ (> 80٪ وړتیا) په کارولو سره د ځواک بډایه کولو وروسته، د واحد حجرو ټرانسکرپټوم ترتیب د 10x 5′جین څرګندولو پروتوکول په کارولو سره په ټول ژوندي کنګل شوي اسایټونو او تومور نمونو باندې ترسره شو. د مطابقت لرونکي تومورونو او اسایټونو سره پنځه قضیې تحلیل شوې، که څه هم د یو تومور نمونې څخه ټیټ وړتیا د هغې شاملولو مخه ونیوله. د ناروغانو ډیری انتخابونو ترلاسه کولو لپاره، موږ د هر ناروغ نمونې د 10x کرومیم کنټرولر په لینونو کې یوځای کړې، او د اسایټونو او تومور سایټونه په جلا توګه تحلیل کړل. د ترتیب کولو وروسته [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp جوړه پای (PE)، کیوبیک جینوم؛ په اوسط ډول د تومور او اسایټ لپاره په هر حجره کې په ترتیب سره 73,488 او 41,378 لوستل]]، موږ د CellSNP او Vireo (53) څخه کار واخیست (د CellSNP پر بنسټ د GRCh38 لخوا چمتو شوی عام انساني SNP (VCF) د بسپنه ورکوونکي پیژندنه ټاکل شوې ده. موږ د ناروغ د جینټایپ حالت (IBS) نږدې پیژندنه (IBS) د استنباط لپاره SNPRelate کاروو، د غیر ټاکل شوي حجرو او حجرو پرته چې د ډوپلیکس په توګه پیژندل شوي او د اسایټ او تومور نمونو ترمنځ د بسپنه ورکوونکو سره سمون خوري (54). د دې دندې پر بنسټ، موږ د ښکته جریان تحلیل لپاره په تومور او اسایټ کې د حجرو پراخه استازیتوب سره درې قضیې وساتلې. د سکیټر (55) او سکران (56) بایو کنډکټر بسته بندۍ کې د ډله ایز فلټریشن مرحلې ترسره کولو وروسته، دا د تحلیل لپاره 6975 حجرې (په ترتیب سره د تومور او اسایټ څخه 2792 او 4183 حجرې) ترلاسه کړې. موږ د شریک نږدې ګاونډی شبکې (SNN) د igraph's (57) Louvain کلسترینګ څخه کار اخلو پر بنسټ د کلستر حجرو ته د اظهار له مخې د جاکارډ واټن. کلسترونه په لاسي ډول د مارکر جین اظهار پراساس د فرضي حجرو ډولونو ته تشریح شوي او د t-SNE سره لیدل شوي. د سایټوټوکسیک T حجرات د CD8A او GZMA د اظهار له مخې تعریف شوي، د ټیټ ریبوسومل پروټین اظهار سره فرعي کلسترونه پرته له دې چې وي. موږ د ایزار او نورو خپاره شوي معلوماتو ته لاسرسی وموند. (16)، د دوی د t-SNE سرایت په شمول، کولی شي د معافیت حجرو مارکرونو او NNMT اظهار ترمنځ د اظهار اوورلیپ کنټرول کړي.
PBMC د لیکوسایټ جلا کولو محصولاتو (STEMCELL ټیکنالوژۍ) څخه د Ficoll ګریډینټ کثافت سنټرفیوګیشن لخوا جلا شوي. CD3 + حجرې د CD3 مڼو (Miltenyi) په کارولو سره د PBMC څخه جلا شوي. د MNA په شتون یا نشتوالي کې، CD3+ حجرې د پلیټ سره تړلي CD3 (5μg/ml)، محلول CD28 (3μg/ml) او IL-2 (300 U/ml؛ Proleukin) سره فعالې شوې. د پراختیا په وروستۍ ورځ، د وړتیا (Fixable Viability Dye eFluor450، eBioscience) او تکثیر (123count eBeads، Thermo Fisher Scientific) د جریان سایټومیټري لخوا ارزول شوي. د GolgiStop سره د PMA (20 ng/ml) او ionomycin (1μg/ml) سره د حجرو د هڅولو له لارې د تاثیر کونکي فعالیت ارزونه وکړئ، او د CD8-PerCP (RPA-T8، BioLegend)، CD4-AF700 (RPA-T4)، BioLegend) او TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11، BD) څارنه وکړئ. د 4 ساعتونو لپاره د PMA (20 ng/ml) او ionomycin (1μg/ml) سره د qPCR او ChIP حجرو هڅونه وکړئ. ELISA supernatant د PMA (20 ng/ml) او ionomycin (1 μg/ml) سره د 4 ساعتونو لپاره د محرک څخه مخکې او وروسته راټول شوی و.
د RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) په کارولو سره د RNA جلا کولو لپاره د جوړونکي پروتوکول تعقیب کړئ. د نمونې د همجنس کولو لپاره QIAshredder (QIAGEN) وکاروئ. د بشپړونکي DNA (cDNA) ترکیب کولو لپاره د cDNA کټ (Thermo Fisher Scientific) ته د لوړ ظرفیت RNA وکاروئ. د لاندې پروبونو سره د جین څرګندونه (د جوړونکي پروتوکول مطابق) اندازه کولو لپاره د TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) وکاروئ: Hs00196287_m1 (NNMT)، Hs00154079_m1 (AOX1)، Hs00427552_m1 (SLC22A1)، Hs02786624_g1 [ګلیسیرالډیهایډ-3-فاسفیټ آف هایدروجن (GAPDH)] او Hs01010726_m1 (SLC22A2). نمونې د StepOnePlus ریښتیني وخت PCR سیسټم (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) کې د MicroAmp فاسټ آپټیکل 96-well ری ایکشن پلیټ (Applied Biosystems) کې د MicroAmp آپټیکل فلم سره چلول شوې. هر Ct ارزښت چې له 35 څخه ډیر وي د کشف حد څخه پورته ګڼل کیږي او د نه کشف کیدونکي په توګه نښه کیږي.
لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي ChIP ترسره کړئ (58). په لنډه توګه، حجرات د فارملډایډ (وروستی غلظت 1.42٪) سره درملنه شوي او د خونې په تودوخه کې د 10 دقیقو لپاره انکیوبیټ شوي. د 10 دقیقو لپاره په یخ کې د ضمیمه شوي پړسوب بفر (25 mM هیپس، 1.5 mM MgCl2، 10 mM KCl او 0.1٪ NP-40) وکاروئ، بیا د معافیت په بفر کې لکه څنګه چې تشریح شوي (58) بیا تعلیق کړئ. بیا نمونه د لاندې دورو سره سونیکیټ شوه: 10 دوره (20 1-ثانوي نبضونه) او د 40 ثانیو جامد وخت. د ChIP درجې امیونوګلوبولین G (د حجرو سیګنال کولو ټیکنالوژي؛ 1μl)، هسټون H3 (د حجرو سیګنال کولو ټیکنالوژي؛ 3μl)، NFAT (انویټروجن؛ 3μl) او SP1 (د حجرو سیګنال کولو ټیکنالوژي؛ 3μl) انکیوبیټ کړئ د نمونې سره د شپې په 4°CC شیک کې. د پروټین A مڼې (ترمو فشر ساینټیفیک) د نمونې سره د 4 درجو سانتی ګراد په تودوخه کې د یو ساعت لپاره په نرمۍ سره وخورئ، بیا د DNA بډایه کولو لپاره چیلیکس مڼې (بایو-راډ) وکاروئ، او د پروټین هضم لپاره پروټینیز K (ترمو فشر) وکاروئ. د TNFα پروموټر د PCR لخوا کشف شو: فارورډ، GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT؛ برعکس، GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp محصول). انځورونه د امیج لیب (بایو-راډ) لخوا تولید شوي او د امیج جے سافټویر په کارولو سره اندازه شوي.
د حجرو کلتور سوپرناټینټ لکه څنګه چې پورته تشریح شوی راټول شو. دا ټاکل د جوړونکي د انساني TNFα ELISA کټ (انویټروجن)، د انسان IL-2 ELISA کټ (انویټروجن) او د انسان IFN-γ ELISA کټ (ابکام) د پروسیجرونو سره سم ترسره شو. د جوړونکي د پروتوکول له مخې، سوپرناټینټ د TNFα او IL-2 کشف کولو لپاره 1:100 او د IFN-γ کشف کولو لپاره 1:3 سره حل شوی و. د 450 nm په اندازه د جذب اندازه کولو لپاره د EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) څخه کار واخلئ.
PBMC د لیکوسایټ جلا کولو محصولاتو (STEMCELL ټیکنالوژۍ) څخه د Ficoll ګریډینټ کثافت سنټرفیوګیشن لخوا جلا شوي. CD3 + حجرې د CD3 مڼو (Miltenyi) په کارولو سره د PBMC څخه جلا شوي. د MNA په شتون یا نشتوالي کې، CD3+ حجرې د پلیټ سره تړلي CD3 (5μg/ml)، محلول CD28 (3μg/ml) او IL-2 (300 U/ml؛ Proleukin) سره د 3 ورځو لپاره فعالې شوې. د 3 ورځو وروسته، حجرې راټولې شوې او د 0.9٪ مالګین سره مینځل شوې، او ګولۍ په ناڅاپي ډول کنګل شوې. د حجرو شمیره د 123count eBeads په کارولو سره د جریان سایټومیټري (Cytek Aurora؛ 3L-16V-14B-8R ترتیب) لخوا ترسره شوه.
لکه څنګه چې پورته تشریح شوي میټابولایټونه استخراج کړئ. وچ شوی استخراج د 4000 حجرو معادل/μl غلظت کې بیا جوړ شو. نمونه د ریورسډ فیز کروماتګرافي (1290 انفینټي II، اګیلینټ ټیکنالوژیانې، سانټا کلارا، CA) او CORTECS T3 کالم (2.1×150 ملي میتر، د ذراتو اندازه 1.6-μm، د مسام اندازه 120-Å؛ #186008500، واټرز) لخوا تحلیل کړئ. قطبي ډله ایز سپیکٹرومیټر (6470، اګیلینټ)، په کوم کې چې الیکټرو سپری آیونیزیشن په مثبت حالت کې کار کوي. ګرځنده مرحله A 0.1٪ فارمیک اسید دی (په H2O کې)، ګرځنده مرحله B 90٪ اسیتونټریل، 0.1٪ فارمیک اسید دی. د LC تدریجي د 100% A لپاره له 0 څخه تر 2 دقیقو پورې، د 99% B لپاره له 2 څخه تر 7.1 دقیقو پورې، او د 99% B لپاره له 7.1 څخه تر 8 دقیقو پورې ده. بیا د 3 دقیقو لپاره د 0.6 ملی لیتر/دقیقې د جریان په کچه د ګرځنده فیز A سره ستنه بیا متوازن کړئ. د جریان کچه 0.4 ملی لیتر/دقیقې ده، او د ستون خونه تر 50 درجو سانتی ګراد پورې تودوخه کیږي. د MNA خالص کیمیاوي معیار (M320995، ټورنټو ریسرچ کیمیکل شرکت، شمالي یارک، اونټاریو، کاناډا) وکاروئ ترڅو د ساتلو وخت (RT) او بدلون (RT = 0.882 دقیقې، بدلون 1 = 137→94.1، بدلون 2 = 137→92، بدلون 3 = 137→78) رامینځته کړئ. کله چې ټول درې لیږدونه په سمه ساتلو وخت کې واقع شي، لیږد 1 د مشخصیت ډاډمن کولو لپاره د مقدار کولو لپاره کارول کیږي. د MNA (ټورنټو ریسرچ کیمیکل شرکت) معیاري منحنی د سټاک محلول (1 mg/ml) د شپږو سیریل ډیلیشنونو لخوا رامینځته شوی ترڅو په ترتیب سره د 0.1، 1.0، 10 او 100 ng/ml او 1.0 او 10μg/ml مایع معیارونه ترلاسه کړي. د کشف حد 1 ng/ml دی، او خطي غبرګون د 10 ng/ml او 10μg/ml ترمنځ دی. د نمونې او معیاري دوه مایکرو لیټرو هر انجیکشن د LC/MS تحلیل لپاره کارول کیږي، او د تحلیل پلیټ فارم ثبات ډاډمن کولو لپاره په هرو اتو انجیکشنونو کې د کیفیت کنټرول مخلوط نمونه چلول کیږي. د ټولو MNA-درمل شوي حجرو نمونو MNA ځوابونه د ازموینې خطي حد کې وو. د معلوماتو تحلیل د MassHunter کمیتي تحلیل سافټویر (v9.0، Agilent) په کارولو سره ترسره شو.
د دوهم نسل αFR-CAR جوړښت د سونګ او نورو څخه اخیستل شوی. (59). په لنډه توګه، جوړښت لاندې محتويات لري: د CD8a مشر ترتیب، د انسان αFR-ځانګړی واحد زنځیر متغیر ټوټه، د CD8a هینګ او ټرانس میمبرین سیمه، د CD27 انټراسیلولر ډومین او د CD3z انټراسیلولر ډومین. بشپړ CAR ترتیب د GenScript لخوا ترکیب شوی و، او بیا د GFP د بیان کیسټ د دوهم نسل لینټی ویروس د بیان ویکتور اپ سټریم ته کلون شوی و چې د لیږد موثریت ارزولو لپاره کارول کیږي.
لینټی ویروس د HEK293T حجرو د لیږد له لارې تولید کیږي [د امریکایی ډول کلتور ټولګه (ATCC)؛ د ډولبیکو په تعدیل شوي ایګل میډیم کې کرل کیږي چې 10٪ د جنین غواګانو سیرم (FBS) او 1٪ PenStrep لري، او د CAR-GFP ویکتور کارول کیږي او د بسته بندۍ پلازمیډونه (psPAX2 او pMD2.G، Addgene) د لیپوفیکشن امین (Sigma-Aldrich) کاروي. د ویروس لرونکی سوپرناټینټ د لیږد څخه 48 او 72 ساعته وروسته راټول شوی، فلټر شوی، او د الټرا سینټرفیوګیشن لخوا متمرکز شوی. متمرکز ویروس سوپرناټینټ د لیږد تر وخته پورې -80 ° C کې ذخیره کړئ.
PBMC د صحي ډونر لیوکوسایټ جلا کولو محصولاتو (STEMCELL ټیکنالوژۍ) څخه د Ficoll ګریډینټ کثافت سنټرفیوګیشن لخوا جلا کیږي. د PBMC څخه د CD8+ حجرو جلا کولو لپاره د مثبت انتخاب CD8 مایکروبیډز (Miltenyi) وکاروئ. د TransAct (Miltenyi) سره او په TexMACS میډیم کې د T حجرو هڅونه وکړئ [Miltenyi؛ د 3٪ تودوخې غیر فعال شوي انساني سیرم، 1٪ PenStrep او IL-2 (300 U/ml) سره ضمیمه شوی]. د محرک څخه څلورویشت ساعته وروسته، T حجرې د لینټی ویروس سره لیږدول شوي (په هر 106 حجرو کې 10 μl متمرکز ویروس سپرنټینټ). د Cytek Aurora (په FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter)، Singlet، GFP+ کې د لیږد وروسته له 1 څخه تر 3 ورځو پورې)، د حجرو د GFP څرګندونه ارزونه وکړئ ترڅو د لیږد موثریت لږترلږه 30٪ وښيي.
د CAR-T حجرات د 24 ساعتونو لپاره په امیونوکلټ (STEMCELL ټیکنالوژۍ؛ د 1٪ PenStrep سره ضمیمه شوي) کې د لاندې شرایطو لاندې کرل شوي: درملنه نه کیږي، د 250 μM اډینوسین یا 10 mM MNA سره درملنه کیږي. د درملنې دمخه، د CAR-T حجرات د PBS سره مینځل شوي او د 20,000 SK-OV-3 حجرو سره یوځای شوي [ATCC؛ په مک کای 5A میډیم (سیګما-الډریچ) کې د 10٪ FBS او 1٪ پینسټریپ سره ضمیمه شوي په 10 کې: د 1 د هدف تناسب ته د تاثیر کونکي د ضمیمه شوي امیونوکلټ میډیم کې په درې اړخیزه توګه لوړ شوی. د SK-OV-3 حجرات او SK-OV-3 حجرات چې د ډیجیټلیس ساپونین (0.5mg/ml؛ سیګما-الډریچ) سره لایز شوي وو په ترتیب سره د منفي او مثبت کنټرولونو په توګه کارول شوي. د ۲۴ ساعتونو ګډ کښت وروسته، سوپرناټینټ راټول شو او د لیټیټ ډیهایډروجنیز (LDH) د جوړونکي د لارښوونو سره سم اندازه شو (LDH ګلو سایټوټوکسیټي اسې کټ، پرومیګا). د LDH سوپرناټینټ په LDH بفر کې ۱:۵۰ حل شوی و. د وژنې سلنه د لاندې فورمول په کارولو سره اندازه شوه: د وژنې سلنه = د سمون سلنه / د وژنې اعظمي کچه x ۱۰۰٪، چیرې چې د سمون سلنه = یوازې د ګډ کلتور-T حجرو، او د وژنې اعظمي کچه = مثبت کنټرول-منفي کنټرول.
لکه څنګه چې په متن یا موادو او میتودونو کې تشریح شوي، د احصایوي تحلیل لپاره د ګراف پیډ پریزم 8، مایکروسافټ ایکسل یا R v3.6.0 وکاروئ. که چیرې ډیری نمونې د ورته ناروغ څخه راټولې شي (لکه اسایټس او تومور)، موږ د جوړه شوي t ازموینه کاروو یا ناروغ د تصادفي اغیزې په توګه په خطي یا عمومي ماډل کې شاملوو لکه څنګه چې مناسب وي. د میټابولومکس تحلیل لپاره، د اهمیت ازموینه په درې ګوني ډول ترسره کیږي.
د دې مقالې لپاره د اضافي موادو لپاره، مهرباني وکړئ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 وګورئ
دا یوه خلاصه لاسرسی لرونکې مقاله ده چې د کریټیو کامنز انتساب-غیر-تجارتي جواز شرایطو لاندې ویشل شوې ده، کوم چې په هر ډول رسنۍ کې د کارولو، ویشلو او تکثیر اجازه ورکوي، تر هغه چې وروستۍ کارول د سوداګریزې ګټې لپاره نه وي او اساس دا وي چې اصلي کار سم دی. حواله.
یادونه: موږ یوازې له تاسو څخه غوښتنه کوو چې خپل د برېښنالیک پته ورکړئ ترڅو هغه کس چې تاسو یې پاڼې ته وړاندیز کوئ پوه شي چې تاسو غواړئ چې دوی برېښنالیک وګوري او دا سپیم نه دی. موږ به هیڅ برېښنالیک پته ونه نیسو.
دا پوښتنه د دې لپاره کارول کیږي چې تاسو لیدونکي یاست او د اتوماتیک سپیم سپارلو مخه ونیسئ.
ماریسا کی. کیلګور (ماریسا کی. کیلګور)، سارا میک فیرسن (سارا میک فیرسن)، لارین جی زکریا (لارین جی. زاکریاس)، ابیګیل ایلی آریس جی واټسن (ایچ واټسن)، جان سټګ (جان سټګ)، براډ ایچ نیلسن (براد ایچ. نیلسن)، براډ ایچ. این. ار. ديبراردينيس)، رسل جي جونز (رسل جي جونز)، فيناس ټي هيملټن (فيناس ټي.
MNA د T حجرو د معافیت په مخنیوي کې مرسته کوي او د انسان د سرطان د درملنې لپاره د معافیت درملنې احتمالي هدف استازیتوب کوي.
ماریسا کی. کیلګور (ماریسا کی. کیلګور)، سارا میک فیرسن (سارا میک فیرسن)، لارین جی زکریا (لارین جی. زاکریاس)، ابیګیل ایلی آریس جی واټسن (ایچ واټسن)، جان سټګ (جان سټګ)، براډ ایچ نیلسن (براد ایچ. نیلسن)، براډ ایچ. این. ار. ديبراردينيس)، رسل جي جونز (رسل جي جونز)، فيناس ټي هيملټن (فيناس ټي.
MNA د T حجرو د معافیت په مخنیوي کې مرسته کوي او د انسان د سرطان د درملنې لپاره د معافیت درملنې احتمالي هدف استازیتوب کوي.
© 2021 د ساینس د پرمختګ لپاره امریکایی ټولنه. ټول حقونه خوندي دي. AAAS د HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef او COUNTER شریک دی. ساینس پرمختګ ISSN 2375-2548.