د Nature.com د لیدنې لپاره مننه. هغه براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ د CSS لپاره محدود ملاتړ لري. د غوره تجربې لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت بند کړئ). په ورته وخت کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه وښیو.
د فقاریه حیواناتو برعکس، حشرات په پراخه کچه فکر کیږي چې د نارینه وو لپاره د جنسي سټرایډ هورمونونو نشتوالی لري. په انافیلز ګمبیا کې، د ایکډیسون سټرایډ 20-هایډروکسی ایکډیسون (20E) داسې ښکاري چې د ښځینه وو لخوا ترکیب شوي هګۍ پراختیا کنټرول کړي او د نارینه وو لخوا د جنسي لیږد پرمهال د ملګرتیا ضد دوره رامینځته کړي. څرنګه چې د هګۍ پراختیا او ملګرتیا اړینه تولیدي ځانګړتیاوې دي، پدې پوهیدل چې څنګه ښځینه انافیلز مچۍ دا هورمونل سیګنالونه مدغم کوي کولی شي د ملاریا کنټرول نوي پروګرامونو ډیزاین اسانه کړي. دلته، موږ ښکاره کوو چې دا تولیدي دندې د ایکډیسټرایډ فعالولو / غیر فعالولو انزایمونو پیچلي شبکې له لارې د جلا جنسي سټرایډونو لخوا تنظیم کیږي. موږ د نارینه وو لپاره ځانګړی اکسیډیز شوی ایکډیسون، 3-ډیهایډرو-20E (3D20E) پیژندلی، چې د جنسي لیږد او ډیفاسفوریلیشن لخوا فعالولو وروسته د ښځینه جنسي جذب بندولو سره د مور او پلار ساتنه کوي. د پام وړ، د 3D20E لیږد د تولیدي جینونو څرګندونه هم هڅولې چې د پلازموډیم انتان په جریان کې د هګۍ پراختیا ساتي، د اخته میرمنو روغتیا ډاډمن کوي. د ښځینه څخه اخیستل شوی 20E جنسي غبرګون نه راپاروي، مګر د جنسي اړیکو اشخاصو ته اجازه ورکوي چې د 20E- مخنیوی کونکو کایناسونو له مخنیوي وروسته هګۍ واچوي. د دې نارینه ځانګړي حشراتو سټرایډ هورمون پیژندنه او د ښځینه جنسي حساسیت، زیږون او د پلازموډیم سره د تعامل تنظیم کولو کې د هغې رول د ملاریا لیږدونکي مچیو د زیږون بریالیتوب کمولو احتمال وړاندیز کوي.
د ملاریا پیښې او مړینې بیا مخ په زیاتیدو دي 4 د انافیلز غوماشو کې د پراخه حشره وژونکو مقاومت له امله، چې د انسانانو د ملاریا پرازیتونو یوازینی لیږدونکی دی. د دې غوماشو د ملګرتیا بیولوژي د ملاریا کنټرول نوي مداخلو لپاره په ځانګړي ډول زړه راښکونکې هدف دی ځکه چې ښځینه یوازې یو ځل ملګرتیا کوي 5؛ د دې واحد ملګرتیا پیښې تعقیم کول به په ساحه کې د مچیو نفوس کمولو لپاره لوی ظرفیت ولري.
ښځې د نارینه وو څخه د لوړ ټایټر سټرایډ هورمونونو ترلاسه کولو وروسته جنسي معلول کیږي. مطالعاتو ښودلې چې د نور ملګرتیا کې د ستونزې لامل 20-هایدروکسی ایکډیسون (20E) دی، یو سټرایډ هورمون چې د لاروا په مرحله کې د مولټینګ دورې تنظیم کونکي په توګه پیژندل کیږي. د نارینه وو وړتیا چې 20E ترکیب او لیږد کړي په ځانګړي ډول د انوفیلس ډولونو کې وده کړې چې د فرعي جینس سیلیا 7 برخه ده، کوم چې په افریقا کې ویشل شوی او د ملاریا ترټولو خطرناک ویکتورونه پکې شامل دي، پشمول د انوفیلس ګمبیا. دا په ځانګړي ډول د پام وړ دی ځکه چې پدې ډولونو کې میرمنې هم د هر وینې خواړو وروسته 20E تولیدوي، او 20E د اوجینیسیس دوره چلوي (حواله 8 وګورئ). په هرصورت، د هغه لارې په اړه لږ څه پیژندل شوي چې څنګه میرمنې د ایکډیسون دوه مختلف سرچینو (نارینه لیږد او د وینې تغذیه کولو هڅونه) څخه سیګنالونه مدغم کوي پرته لدې چې د دوی د ملګرتیا وړتیا سره موافقت وکړي. په حقیقت کې، که چیرې د میرمنو لخوا تولید شوی 20E جنسي عدم برداشت رامینځته کړي، دا به د کنوارې تغذیه کونکو اشخاصو کې د بانجھ کیدو لامل شي، په دې مچیو کې یو ډیر عام چلند.
یو احتمالي توضیح دا دی چې د A. gambiae نارینه یو تعدیل شوی نارینه ځانګړی ایکډیسون لیږدوي، کوم چې د ښځینه تناسلي لارې کې د سیګنال کولو کاسکیډ فعالوي، چې پایله یې د ملګرتیا بې ثباتي ده. په هرصورت، که څه هم فقاریه حیوانات ډیری سټرایډ هورمونونه لري، لکه ایسټروجن او انډروجن (په ریف. 9 کې بیاکتنه شوې)، زموږ د پوهې له مخې، په حشراتو کې د انډروجنیک تعصب لرونکي سټرایډونه ندي پیژندل شوي.
موږ د جنسي پلوه بالغ A. gambiae د نارینه وو د لاسرسي غدې (MAG) کې د سټرایډ هورمونونو ذخیره ټاکلو لپاره د ممکنه تعدیل شوي سټرایډونو په لټه کې پیل وکړ. د لوړ فعالیت مایع کروماتګرافي په کارولو سره چې د ټنډم ماس سپیکٹرومیټري (HPLC-MS/MS) سره یوځای شوی د هغه لږ ځانګړي میتود پرځای چې مخکې کارول کیده، موږ په دې نسج کې ایکډیسون (E) او 20E کشف کړل، چې پخوانۍ پایله یې تایید کړه. په هرصورت، نمونه د اکسیډیز شوي فاسفوریلیټ سټرایډونو لخوا تسلط درلود، د فورمول 3-dehydro-20E-22-فاسفیټ (3D20E22P)12 سره مطابقت لري (شکل 1). په نورو بڼو کې 3-dehydro-20E (3D20E) او 20E-22-فاسفیټ (20E22P) شامل دي. د 3D20E22P د HPLC-MS/MS سیګنال شدت د هغې د ډیفاسفوریلیټ شوي بڼې، 3D20E څخه دوه درجې لوړ و، او د E او 20E څخه درې درجې لوړ و (شکل ۱). که څه هم د بدن په نورو برخو او د تناسلي لارې په ښکته برخه کې (LRT؛ پراخ شوي معلومات انځور ۱ الف). موږ په نوي تړل شوي (<۱ ورځې زاړه) نارینه او ښځینه کې هم ایکډیسټرایډونه تحلیل کړل او یوازې په MAG کې 3D20E او 3D20E22P وموندل؛ E، 20E او 20E22P په دواړو جنسونو کې شتون درلود (غزیدلي معلومات انځور ۱ ب). دا معلومات وړاندیز کوي چې د A. gambiae بالغ نارینه په خپلو MAGs کې د تعدیل کونکي هورمونونو لوړ ټایټرونه تولیدوي چې د ښځینه لخوا ترکیب شوي ندي.
MAG او ښځینه LRT (د ایټریا، سیمینل ویسیکلونو، او پاروویریم په شمول) د 4 ورځو (4 ورځو) کنوارو نارینه وو او کنوارو او جوړه شوې ښځینه وو (0.5، 3، او 12 hpm) څخه جلا شوي. په دې نسجونو کې ایکډیسون د HPLC-MS/MS لخوا تحلیل شوی (اوسط ± sem؛ غیر جوړه t-ټیسټ، دوه اړخیزه، غلط کشف کچه (FDR) سم شوی؛ NS، د پام وړ نه دی؛ *P < 0.05، **P < 0.01. 3D20E: 3 ساعته د 0.5 ساعتونو په وړاندې، P = 0.035؛ 12 ساعته د 3 ساعتونو په وړاندې، P = 0.0015؛ 12 ساعته د 0.5 ساعتونو په وړاندې، P = 0.030. 3D20E22P: 3 ساعته د 0.5 ساعتونو په وړاندې، P = 0.25؛ 12 ساعته د 3 په وړاندې ساعتونه، P = 0.0032؛ 12 ساعته د 0.5 ساعتونو په مقابل کې، P = 0.015). معلومات د دریو بیولوژیکي نقلونو څخه دي. د هر ایکډیسون لپاره د لوړې ساحې محاسبه او د مچیو د شمیر له مخې نورمال شوې. ایکډیسون د رنګ له مخې په لاندې ډول ښودل کیږي: E، شنه؛ 20E، نارنجي؛ 20E22P، ارغواني؛ 3D20E، نیلي؛ 3D20E22P، ګلابي. انسیټ د y-محور پیمانه زیاتوي ترڅو د ایکډیسون ټیټه کچه وښيي.
د دې لپاره چې معلومه کړو چې ایا 3D20E22P او 3D20E د جنسي اړیکو په جریان کې لیږدول کیږي، موږ د جنسي اړیکو وروسته په مختلفو وختونو کې ښځینه LRTs تحلیل کړل. که څه هم په پیغلو کې ایکډیسون ونه موندل شو، موږ د جنسي اړیکو سمدلاسه وروسته په LRT کې د 3D20E22P د پام وړ مقدار ولیدل (0.5 ساعته د ملګرتیا وروسته، hpm)، د وخت په تیریدو سره کم شو، پداسې حال کې چې د 3D20E کچه د پام وړ لوړه شوه (شکل 1). د کیمیاوي ترکیب شوي 3D20E معیار په توګه کارولو سره، موږ معلومه کړه چې د جنسي اړیکو LRTs کې د دې سټرایډ هورمون کچه لږترلږه د 20E څخه 100 ځله لوړه وه (د معلوماتو پراخه جدول 1). په دې توګه، 3D20E22P لوی نارینه ایکډیسون دی چې د جنسي اړیکو په جریان کې ښځینه LRT ته لیږدول کیږي، او د هغې ډیفاسفوریلیټ شوی بڼه، 3D20E، د جنسي اړیکو وروسته ډیر ژر ډیریږي. دا د ښځینه وروسته د جنسي اړیکو بیولوژي کې د وروستي ایکډیسون لپاره مهم رول وړاندیز کوي.
د نوي RNA ترتیب (RNA-seq) ډیټاسیټ (شکل 2a) رامینځته کولو وروسته، د دودیز جوړ شوي بایو انفارمیټکس پایپ لاین په کارولو سره، موږ د ایکډیسون کایناز (EcK)، ایکډیسون اکسیډیز (EO)، او ایکډیسون کوډ کولو لپاره د 20E-تعدیل شوي فاسفیټیس جین لټون وکړ. EPP) په تولیدي نسجونو کې څرګندیږي. موږ یو نوماند EPP جین او دوه احتمالي EcK جینونه (EcK1 او EcK2) وپیژندل، مګر د ښه نوماند EO جین موندلو توان نلرو. د پام وړ، انفرادي EPP جینونه په ګمبیا MAGs کې په لوړه کچه (98.9 سلنه سلنه) څرګند شوي مګر په ښځینه LRTs کې نه (شکل 2b)، زموږ د تمو برعکس ځکه چې د 3D20E22P ډیفاسفوریلیشن پدې ښځینه نسج کې پیښ شو. له همدې امله، موږ باور لرو چې نارینه EPP ممکن د ملګرتیا پرمهال لیږدول شي. په حقیقت کې، موږ د ملګرتیا وروسته د ښځینه پروټین د ماسک کولو لپاره د ویوو مستحکم آیسټوپ لیبلینګ څخه کار واخیست، یو انزایم چې د MS لخوا په ښځینه ایټریوم کې پیژندل شوی (شکل 2c او ضمیمه جدول). ۱). په MAG او جوړه شوې (مګر کنواره نه) ښځینه LRT کې د EPP شتون هم د ځانګړو انټي باډیزونو په کارولو سره تایید شو (انځور ۲d).
الف، د هر جنس د تناسلي نسجونو د لټون لپاره د EcKs، EOs، او EPPs کوډ کولو جینونو لپاره د بایو انفارمیټکس یوه دودیزه پایپ لاین. د تیرونو تر څنګ شمیرې په هر ګام کې د نارینه او ښځینه نوماندانو شمیر په ګوته کوي. دې تحلیل یو EPP جین (EPP) او یو EcK جین (EcK1) پیژندلی چې په نارینه وو کې څرګندیږي، او یو EcK جین (EcK2) چې په دواړو جنسونو کې څرګندیږي مګر د کاندید EO جین نه تولیدوي.b، هیټ میپ د کنوارې (V) او ملګرتیا (M) انوفیلز ګمبیا او انوفیلز البیکانز نسجونو کې د کاندید جین څرګندونه پرتله کوي. Spca، القاح؛ MAGs، په نارینه وو کې د لاسرسي غدې؛ د بدن نورې برخې، په شمول د سینې، وزرونو، پښو، غوړ بدنونو، او په دواړو جنسونو کې داخلي ارګانونه، او په ښځینه کې تخمدانونه. EcK2 په MAG او د ګمبیا په اټریا دواړو کې خورا څرګند شوی، پداسې حال کې چې EPP یوازې په MAG کې موندل کیږي.c، د نارینه انزال ګروپ د ښځینه اټریا ته د لیږد پروټیومیک تحلیل په 3، 12 او 24 hpm کې، چې 67 خورا بډایه پروټینونه ښیې. ښځې په داسې رژیم کې لویې شوې چې 15N لري ترڅو ټول پروټینونه لیبل کړي (او ماسک کړي). غیر ټګ شوي نارینه د ټګ شوي ښځینه سره یوځای شوي وو، او ښځینه LRTs د پروټومیک تحلیل لپاره په 3، 12 او 24 hpm کې تحلیل شوي وو (د انزال پروټینونو بشپړ لیست لپاره ضمیمه جدول 1 وګورئ). د دې نسجونو د پروټومیک تحلیل لخوا د کنوارو نارینه وو په MAG کې انسټیټ، EPP، Eck1 او EcK2 کشف شوي.d، EPP د MAG او د مل شوي ښځینه وو LRT کې د لویدیځ بلاټ لخوا کشف شوی و، مګر د کنوارو میرمنو یا نارینه وو یا پاتې ښځینه وو کې نه. بدن. غشاګانې په ورته وخت کې د انټي ایکټین (د بارولو کنټرول) او انټي EPP انټي باډیز سره معاینه شوې. ټول نارینه کنوارې دي. د جیل سرچینې معلوماتو لپاره ضمیمه شکل 1 وګورئ. لویدیځ بلاټونه د ورته پایلو سره دوه ځله ترسره شوي.
د EPP د ایکډیسټرایډ فاسفوفاسفاتیز فعالیت د HPLC-MS/MS لخوا د 3D20E22P سره د MAG څخه جلا کولو وروسته تایید شو (د پراخ شوي معلوماتو شکل 2a). سربیره پردې، کله چې موږ د RNA-منځګړیتوب مداخلې (RNAi) لخوا EPP خاموش کړ، موږ د دې نارینه وو د تولیدي نسجونو کې د فاسفاتیز فعالیت کې قوي کمښت وموند (شکل 3a)، او هغه میرمنې چې د EPP-خاموش شوي نارینه وو سره یوځای شوې وې د جزوي جین خاموش کولو سره سره د ډیفاسفوریلیټ شوي 3D20E (شکل 3b) ټیټ تناسب د پام وړ وښود (د پراخ شوي معلوماتو شکل 2b، c). برعکس، موږ په ورته مچیو کې د 20E22P/20E تناسب کې د پام وړ بدلونونه ونه موندل، کوم چې ممکن وړاندیز وکړي چې انزایم د 3D20E22P لپاره ځانګړی دی (شکل 3b).
a، په MAG کې د فاسفیتس فعالیت کم شوی چې د EPP د دوه ګوني EPP RNA (dsEPP) یا دوه ګوني GFP RNA (dsGFP) کنټرولونو په کارولو سره د خاموش کولو له امله رامینځته شوی. په هر نقل کې شل MAG حوضونه کارول شوي (P = 0.0046، جوړه t-ټیسټ، دوه اړخیزه)، چې د جلا نقطو لخوا استازیتوب کیږي. b، هغه میرمنې چې د EPP خاموش شوي نارینه وو سره یوځای شوي د 3 hpm (P = 0.0043، غیر جوړه t-ټیسټ، دوه اړخیزه) کې د ډیفاسفوریلیټ 3D20E د پام وړ ټیټ تناسب درلود، پداسې حال کې چې د 20E کچه غیر اغیزمنه وه (P = 0.063، غیر جوړه). د t-ټیسټ، دوه اړخیزه). معلومات د 13، 16 او 19 ښځینه وو د دریو حوضونو څخه د اوسط ± سیم په توګه وړاندې کیږي. c، هغه میرمنې چې د EPP-خاموش نارینه وو سره یوځای شوي د بیا یوځای کیدو کچه د پام وړ لوړه وه (P = 0.0002، د فشر دقیق ازموینه، دوه اړخیزه). ښځې لومړی د دوی د یوځای کیدو حالت ډاډمن کولو لپاره یوځای کیدو ته اړ ایستل شوې وې؛ دوه ورځې وروسته، دوی د نورو نارینه وو سره چې د ټرانسجینک سپرم لیږدونکي وو اړیکه ونیول شوه ترڅو د ټرانسجین د کمیتي PCR کشف له لارې د بیا یوځای کیدو کچه وارزوي. d، د وینې تغذیه شوي میرمنو چې د EPP خاموش نارینه وو سره یوځای شوي وو د زیږون کچه یې د پام وړ کمه کړې وه (P < 0.0001؛ د مان-ویټني ازموینه، دوه اړخیزه) او د هګیو شمیر یو څه کم شوی و (P = 0.088، د مان-ویټني ازموینه، دوه اړخیزه)، پداسې حال کې چې د زیږون کچه اغیزمنه نه شوه (P = 0.94، د فشر دقیق ازموینه، دوه اړخیزه). په ټولو پینلونو کې، n د بیولوژیکي پلوه خپلواک مچیو نمونو شمیر استازیتوب کوي. NS، د پام وړ ندي.*P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، ****P < 0.001.
بیا، موږ ارزونه وکړه چې ایا د ایکډیسون ډیفاسفوریلیشن په ښځو کې د ملګرتیا مقاومت رامینځته کولو لپاره مهم دی. د پام وړ، هغه میرمنې چې د EPP له منځه تللي نارینه وو سره یوځای کیږي د کنټرول ښځینه وو (10.4٪) په پرتله په ډیره لوړه فریکونسۍ (44.9٪) کې بیا یوځای کیږي کله چې د اضافي (ټرانسجینک) نارینه وو سره مخ کیږي (انځور 3c). موږ د زیږون په برخه کې د پام وړ کمښت (انځور 3d، کیڼ) او د دې میرمنو لخوا د ایښودل شویو هګیو په شمیر کې یو څه کمښت هم ولید (انځور 3d، منځنی)، پداسې حال کې چې د میرمنو لخوا ایښودل شوي هګیو سلنه (یو بل غبرګون چې د ملګرتیا له لارې په میرمنو کې رامینځته کیږي)) اغیزمن نه شو (انځور 3d، ښي). د 3D20E22P لپاره د EPP لیدل شوي ځانګړتیا ته په پام سره، دا پایلې وړاندیز کوي چې د ملګرتیا پرمهال لیږدول شوي EPP لخوا د 3D20E فعالول ممکن د نورو ملګرتیا لپاره د ښځینه حساسیت بندولو کې مهم رول ولري، یو چلند چې دمخه د 20E جنسي لیږد ته منسوب شوی و. له همدې امله، دا نارینه ځانګړی هورمون هم د ښځینه زیږون په کلکه اغیزه کوي.
بیا، موږ د کیمیاوي ترکیب شوي 3D20E (انځور 4a-c) او سوداګریزې شتون لرونکي 20E په کارولو سره په جنسي بالغو پیغلو کې د انجیکشن تجربو کې د 20E او 3D20E فعالیتونه پرتله کړل. موږ ولیدل چې 3D20E د 20E په پرتله د پام وړ ډیر اغیزمن و چې په دواړو غلظتونو کې د جنسي اړیکې لپاره د ښځینه حساسیت بندولو کې (انځور 4d). د پام وړ، په LRT کې د 3D20E نیمایي فیزیولوژیکي کچه (1,066 pg د انجیکشن وروسته د انجیکشن په مقابل کې 2,022 pg د ملګرتیا وروسته) د انعطاف منونکو میرمنو تناسب رامینځته کړ چې د 20E د فزیولوژیکي کچې (361 pg د انجیکشن وروسته) څخه 24 ساعته لوړ و. د انجیکشن وروسته د 18 pg لوړ غلظت کې؛ د معلوماتو پراخ شوی جدول ۱). دا پایله د دې مفکورې سره سمون لري چې د 20E جنسي لیږد د ملګرتیا د مخنیوي دورې لامل نه کیږي، او نور 3D20E ته د مور او پلار او ماشوم اړیکو ډاډمن کولو کې د لوی فکتور په توګه اشاره کوي. 3D20E د کنوارو میرمنو کې د هګیو اچولو په ارزونو کې د 20E په پرتله د پام وړ ډیر فعال و (شکل 4e)، دا وړاندیز کوي چې د هګیو اچولو عادي کچه چې موږ د EPP د جزوي خاموشۍ وروسته ولیدله د پاتې 3D20E فعالیت شتون له امله وه چې لاهم د ملګرتیا هڅول شوي ښځینه فکتورونو لخوا تولید کیږي.
(a,b) 3D20E په کیمیاوي ډول د 20E څخه ترکیب شوی (a) د ډیر لوړ تبادلې/موثریت سره (ډاټا د دریو خپلواکو ترکیبي تعاملاتو څخه د اوسط ± سیم په توګه وړاندې کیږي) (b).c، د ډله ایز سپیکٹرم (لاندې نیمایي) په سمه توګه د یوځای شوي ښځینه LRT (پورته نیمایي) کې موندل شوي ایکډیسون سره سمون لري.d، د 20E (0.63 µg، P = 0.02؛ 0.21 µg، P < 0.0001؛ د فشر دقیق ازموینه، دوه اړخیزه) او 10٪ ایتانول (0.63 µg، P < 0.0001؛ 0.21 µg، P < 0.0001؛ د فشر دقیق ازموینه، دوه اړخیزه) سره پرتله کیږي، پداسې حال کې چې 20E یوازې په لوړو دوزونو کې د کنټرول څخه د پام وړ لوړ و (0.63 µg، P = 0.0002؛ 0.21 µg، P = 0.54؛ د فشر دقیق ازموینه، دوه اړخیزه).e، د 3D20E انجیکشن د 10٪ ایتانول کنټرولونو په پرتله په کنوارو میرمنو کې د زیږون کچه د پام وړ لوړه کړې (0.21 µg، P < 0.0001؛ 0.13 µg، P = 0.0003؛ د فشر دقیق ازموینه، دوه اړخیزه)، پداسې حال کې چې 20E د کنټرولونو په پرتله یوازې په لوړو دوزونو کې (0.21 µg، P = 0.022؛ 0.13 µg، P = 0.0823؛ د فشر دقیق ازموینه، دوه اړخیزه).3D20E د 20E په پرتله په لوړو دوزونو کې د پام وړ لوړه د زیږون کچه رامینځته کړې (0.21 µg، P = 0.0019؛ 0.13 µg، P = 0.075؛ د فشر دقیق ازموینه، دوه اړخیزه). په ټولو پینلونو کې، n د بیولوژیکي پلوه خپلواک مچیو نمونو شمیر استازیتوب کوي.NS، د پام وړ نه دی.*P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، ****P < 0.001. معلومات د دریو نقلونو څخه دي.
په تیرو مطالعاتو کې، موږ معلومه کړه چې د سټرایډ هورمونونو جنسي لیږد د MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) څرګندونه هڅوي، یو ښځینه تولیدي جین چې د A. gambiae میرمنې د P. falciparum انتان څخه ساتي. د روغتیا لګښتونه چې د 13 لخوا رامینځته کیږي، د ملاریا ترټولو وژونکي پرازیت. د ملاریا په سیمو کې د انوفیلس د تولیدي فټنس لپاره د MISO اهمیت ته په پام سره، موږ پریکړه وکړه چې معلومه کړو چې کوم هورمون 3D20E یا 20E د دې جین څرګندونه هڅوي. موږ وموندله چې پداسې حال کې چې 20E انجیکشن په ځانګړي ډول یا ډیر قوي ډول ځینې اټومي هورمون ریسیپټرونه (HR) هڅوي، لکه HR3 او HR4، او د سټرایډ عادي هدفونه، لکه یولکوجینک جینونه Vg14، 15، 16، MISO ډیر قوي د 3D20E لخوا هڅول شوی و (د پراخ شوي معلوماتو شکل 3). په دې توګه، د دې انډروجنیک سټرایډ هورمون جنسي لیږد داسې ښکاري چې میکانیزمونه هڅوي چې میرمنې د پرازیتي انتان لخوا رامینځته شوي لګښتونو څخه ساتي. سربیره پردې، 3D20E د E ریسیپټر EcR دواړو ایزوفارمونو باندې په توپیر سره اغیزه کوي، EcR-A هڅوي او EcR-B فشاروي، او په ډیر قوي ډول د HPX15 په ګډون د نورو ملګرتیا هڅونکي جینونو هڅوي، کوم چې د ښځینه زیږون اغیزه کوي. دا کولی شي د EPP خاموش نارینه وو سره یوځای شوي میرمنو کې لیدل شوي د پام وړ بانجھ والي تشریح کړي (د پراخ شوي معلوماتو شکل 3). دا معلومات د ښکته جریان لارو شتون وړاندیز کوي چې په غوره توګه د دوه ایکډیسون هورمونونو لخوا فعال شوي چې ممکن د جنس ځانګړي فعالیت لاندې راولي.
بیا، موږ د دوو EcK جینونو فعالیت ازموینه وکړه چې زموږ په بایو انفارمیټکس پایپ لاین کې پیژندل شوي. د EcK1 یا EcK2 خاموش کول په نارینه وو کې د پام وړ مړینې لامل شوي (د پراخ شوي معلوماتو شکل 4a)، دا وړاندیز کوي چې د ایکډیسون فاسفوریلیشن، او پدې توګه غیر فعال کول، د ژوندي پاتې کیدو لپاره مهم دي. ځکه چې EcK2 د EcK1 په پرتله په لوړه کچه څرګند شوی و او د پروټومیکس لخوا په MAGs کې کشف شوی و (شکل 2b، c او ضمیمه جدول 2)، موږ د 20E سره د انکیوبیټ کولو له لارې د دې د ایکډیسټرایډ کایناز فعالیت تایید کړ، چې پایله یې د فاسفوریلیشن 20E22P (د پراخ شوي معلوماتو شکل 2).4b). کله چې 3D20E د سبسټریټ په توګه کاروو، موږ نشو کولی د فاسفوریلیټ شوي محصول 3D20E22P (د پراخ شوي معلوماتو شکل 4c) کشف کړو، دا وړاندیز کوي چې د 3D20E پرځای 20E ممکن د EcK2 غوره هدف وي.
زموږ د RNA-seq تحلیل له مخې، EcK2 د کنوارو ښځو په LRT کې هم په لوړه کچه څرګند شو، چیرې چې دا د ملګرتیا وروسته بند شو (انځور 2b). موږ دا معلومات تایید کړل او معلومه کړه چې د EcK2 څرګندونه د وینې تغذیه کولو لخوا اغیزمنه نه وه (د پراخ شوي معلوماتو انځور 5a). زموږ د لومړنیو MS تجربو پراخولو سره، موږ معلومه کړه چې د 20E22P لوړوالی د 20E لوړوالی سره نږدې تړاو درلود (د وینې خواړو وروسته 22-26 ساعته؛ د پراخ شوي معلوماتو انځور 5b). په کنوارو میرمنو کې د EcK2 خاموش کول د وینې خواړو وروسته په 26 ساعتونو کې د 20E څخه تر 20E22P پورې د نسبي تناسب کې 3 ځله زیاتوالی رامینځته کړ (د پراخ شوي معلوماتو انځورونه 2c او 5c)، دا تاییدوي چې EcK2 په میرمنو کې 20E هم فاسفوریلیټ کوي. د پام وړ، د EcK2 کم شوي کنوارو بشپړ جنسي حساسیت ساتلی (د پراخ شوي معلوماتو انځور 5d،e)، نور وړاندیز کوي چې د 20E ښځینه تولید د ملګرتیا انعطاف نه هڅوي دورې. په هرصورت، دغو میرمنو د کنټرول په پرتله د هګیو اچولو کچه د پام وړ لوړه کړې وه، د 30٪ څخه زیاتو پیغلو هګۍ اچولې وې (د پراخ شوي معلوماتو انځور 5f). که چیرې د وینې له تغذیې وروسته دوه ګونی سټرنډ شوي Eck2 RNA (dsEcK2) انجیکشنونه ترسره شوي وي، نو د سپونینګ نه پیښیږي، په کوم ځای کې چې د وینې د جذب له امله د 20E لوړوالی کم شوی و. په ټولیز ډول، دا پایلې د هغه ماډل ملاتړ کوي چې 20E د وینې له څښلو وروسته تولید کیدی شي د سپونینګ لامل شي، مګر یوازې هغه وخت چې د سپونینګ بلاک (EcK2 او ممکن نور عوامل) د ملګرتیا له لارې بند شي. نه 20E او نه هم 3D20E انجیکشنونه په پیغلو کې د EcK2 څرګندونه منع کوي (د پراخ شوي معلوماتو انځور 5g)، دا وړاندیز کوي چې نور عوامل د دې کیناز مخنیوی منځګړیتوب کوي. په هرصورت، د وینې له تغذیې وروسته د 20E کچه د ملګرتیا د تکلیف د رامینځته کولو لپاره کافي نه وه، مګر په مؤثره توګه د جنسي لیږد شوي 3D20E لوړ ټایټرونو لخوا رامینځته شوې.
زموږ پایلې د A. gambiae د زیږون بریالیتوب تنظیمولو میکانیزمونو په اړه مهم بصیرتونه وړاندې کوي. یو ماډل راڅرګند شوی چیرې چې نارینه د 3D20E لوړ ټایټرونو ترکیب کولو لپاره وده کړې، یو نارینه ځانګړی تعدیل شوی ایکډیسون چې د نورو ملګرتیا لپاره د ښځینه غیر حساس کولو سره د والدینیت ډاډ ورکوي. په ورته وخت کې، د ملاریا دې ویکتورونو د نارینه ځانګړي EPP د جنسي لیږد په ځواب کې په میرمنو کې د 3D20E فعالولو لپاره یو اغیزمن سیسټم هم رامینځته کړی. زموږ د پوهې له مخې، دا د نارینه او ښځینه واکمن سټرایډ هورمون سیسټم لومړۍ بیلګه ده چې په حشراتو کې یو ځانګړی او مهم فعالیت ترسره کوي. د نارینه ځانګړي ایکډیسون فعالیت فرض شوی مګر په قطعي ډول نه دی ښودل شوی. د مثال په توګه، په لویه کچه رد شوی فرضیه 18 دا ده چې دا دندې ممکن د 20E مخکیني E1 لخوا ترسره شي. دا ښه پیژندل شوی چې په ډروسوفیلا کې، مونانډري د کوچني جنسي پیپټایډونو د جنسي لیږد لخوا رامینځته کیږي 19,20 چې د ځانګړي جنسي پیپټایډ ریسیپټرونو له لارې د ښځینه تناسلي لارې ته ننوځي 21,22. نور کار دی د A. gambiae ښځینه وو کې د 3D20E لخوا کنټرول شوي د ښکته سیګنلینګ کاسکیډونو ټاکلو لپاره او دا معلومه کولو لپاره چې ایا دا کاسکیډونه د مچیو او ډروسوفیلا ترمنځ ساتل کیدی شي.
زموږ په څیړنه کې د ښځینه زیږون او چلند په اړه د 3D20E مهم رول ته په پام سره، د 3D20E ترکیب او فعالولو ته لار هواروي لارې د راتلونکي مچیو کنټرول ستراتیژیو لپاره نوي فرصتونه وړاندې کوي، لکه د جراثیم ضد حشراتو ټیکنالوژۍ ستراتیژیو کې د سیالي کونکي جراثیم ضد نارینه نسل د وحشي خوشې کولو لپاره کارول یا د ورجن لوبې کې د 3D20E تقلید کول. د 3D20E نارینه ځانګړي فعالیت ممکن هغه وخت رامینځته شوی وي کله چې A. gambiae او نورو سیلیا ډولونو د دوی منی د ملګرتیا پلګونو کې د راټولولو وړتیا ترلاسه کړه، ځکه چې دا د لوی شمیر هورمونونو او هورمون فعالولو انزایمونو اغیزمن لیږد ته اجازه ورکوي. په بدل کې، د 3D20E ارتقاء پلي کول مونانډري د ښځو لپاره یو میکانیزم چمتو کوي (د MISO لوړ څرګندولو له لارې) د لوړ ملاریا خپریدو سیمو کې د دوی د تولید فټنس ملاتړ کوي، کوم چې په غیر مستقیم ډول د پلازموډیم لیږد کې مرسته کوي. په پام کې نیولو سره چې ښځینه 20E د ښځینه انوفیلس مچیو کې د P. falciparum په بقا او ودې باندې ژور اغیزې لري، 24 دواړه نارینه او ښځینه سټرایډ هورمون لارې اوس د مچیو پرازیتونو کلیدي اړخونه دي. تعاملات.
د الف. gambiae G3 ډولونه د معیاري حشراتو شرایطو لاندې پالل شوي (26-28 °C، 65-80٪ نسبي رطوبت، 12:12 ساعته رڼا/تیاره فوتوپیریډ). لاروا ته د پوډر شوي کب خواړه ورکړل شول (د TetraMin Tropical Flakes، Koi Pellets او Tetra Pond Sticks د 7:7:2 په تناسب کې). لویانو مچیو ته د اډ لیبیټم 10٪ ډیکسټروز محلول او په اونۍ کې د انسان وینه ورکړل شوه (د وینې اجزا مطالعه کړئ). د ورجن مچیو د مایکروسکوپي لخوا د پایونو معاینه کولو وروسته د پوپل په مرحله کې د جنسونو جلا کولو سره ترلاسه شوي. هغه نارینه چې د DsRed ټرانسجین لیږدوي مخکې تشریح شوي.
د جبري ملګرتیا تجربې د مخکې تشریح شوي پروتوکولونو سره سم ترسره شوې. د طبیعي ملګرتیا لپاره، د 4 ورځو عمر لرونکې میرمنې د دوه شپې لپاره د جنسي پلوه بالغو میرمنو سره د 1:3 تناسب کې ساتل شوې وې. د هغو تجربو لپاره چې نارینه وو ته د dsEPP سره انجیکشن ورکړل شوی و، د انجیکشن وروسته د 3-4 ورځو سره ګډ کیج کول، کله چې د فاسفیتس فعالیت په اعظمي ډول خاموش شو (غزول شوي معلومات شکل 2b).
د مچیو نسجونه، پاتې مړي (د بدن پاتې برخه)، یا ټول بدن په 100٪ میتانول کې ویشل شوي او د بیډر (2 ملي میتر شیشې مڼې، 2,400 rpm، 90 ثانیې) سره همغږي شوي. د نسجونو اندازه او د میتانول حجم په لاندې ډول وو: د بدن پاتې برخه، 50 په 1,000 µl کې؛ MAG، 50-100 80 µl؛ ښځینه LRT، 25-50 80 µl. د میتانول د ورته حجم سره د میتانول دوهم استخراج سره مخ شو. د حجرو کثافات د سینټرفیوګیشن لخوا لرې شول. د دواړو استخراجونو څخه میتانول یوځای شو او د نایتروجن جریان لاندې وچ شو، بیا په اوبو کې د 80٪ میتانول په لاندې حجمونو کې بیا وځنډول شو: د بدن پاتې برخه، 50 µl؛ MAGs او ښځینه LRT، 30 µl.
نمونې د ډله ایز سپیکٹرومیټر (ID-X، ترمو فشر) په واسطه تحلیل شوې چې د LC وسیلې (Vanquish، ترمو فشر) سره یوځای شوې. د نمونې 5 µl د 3 µm، 100 × 4.6 ملي میتر ستون (Inspire C8، Dikma) ته داخل شو چې په 25 °C کې ساتل شوی و. د LC لپاره ګرځنده مرحلې A (اوبه، 0.1٪ فارمیک اسید) او B (acetonitrile، 0.1٪ فارمیک اسید) وې. د LC تدریجي په لاندې ډول وه: د 1 دقیقې لپاره 5٪ B، بیا په 11 دقیقو کې 100٪ B ته لوړ شو. د 8 دقیقو وروسته په 100٪ کې، ستون د 4 دقیقو لپاره په 5٪ B کې بیا متوازن کړئ. د جریان کچه 0.3 ملی لیتره لږترلږه -1 وه. د MS سرچینې کې آیونیزیشن په مثبت او منفي حالتونو کې د تودوخې الیکټرو سپری آیونیزیشن لخوا ترسره کیږي.
د ډله ایز سپیکٹرومیټر په بشپړ MS حالت کې د 60,000 ریزولوشن سره د 350 څخه تر 680 پورې د m/z حد کې معلومات اندازه کوي. د MS/MS معلومات په [M + H]+ (ټول هدفونه)، [M - H2O + H]+ (ټول هدفونه)، او [M - H]- (فاسفوریلیټ شوي هدفونه) کې ترلاسه شوي. د MS/MS معلومات د هغو هدفونو د ایکډیسون ملکیتونو تایید لپاره کارول شوي چې هیڅ معیار شتون نلري. د غیر هدف لرونکي ایکډیسټرایډونو پیژندلو لپاره، د ټولو HPLC څوکو لپاره د MS/MS معلومات د 15٪ څخه ډیر نسبي کثرت سره تحلیل شوي. د خالص معیارونو (20E، 3D20E) څخه رامینځته شوي معیاري منحني په کارولو سره اندازه کول ترڅو د یوې ځانګړې نمونې (ټولو نورو هدفونو) مطلق مقدار یا تحلیل محاسبه شي ترڅو د دوی مساوي په یو نارینه کې موندل شوي مقدارونو سره محاسبه شي. د 3D20E لپاره، اندازه کول د لاندې اضافه کونکو مجموعې په کارولو سره ترسره شوي: [M + TFA]-، [M + COOH]-، [M + Na]+، [M + Cl]-، [M + NO3]-. معلومات د Tracefinder (نسخه 4.1) په کارولو سره استخراج او اندازه شوي. د MS/MS معلومات د Xcalibur (نسخه 4.4) په کارولو سره تحلیل شوي. د E، 20E او 3D20E MS سپیکٹرا د اړوندو معیارونو سره پرتله شوي. 3D20E22P د ګیرارډ د ریجنټ سره د مشتق کولو له لارې تحلیل شوی. 20E22P د m/z تناسب له مخې تحلیل شوی.
3D20E22P د MAG څخه پاک شو. پاکول د الټرا-پرفارمنس مایع کروماتګراف (ایکویټي، واټرز) په کارولو سره د کواډروپول ماس پر بنسټ کشف کونکي (QDa، ایکویټي، واټرز) په کارولو سره د HPLC-MS/MS تحلیل په څیر ورته LC شرایطو لاندې ترسره شو. د کسر راټولول هغه وخت پیل شو کله چې د 3D20E22P سره مطابقت لرونکی m/z په ورته ساتلو وخت کې وموندل شو لکه څنګه چې مخکې ټاکل شوی و. د استخراج شوي مرکباتو پاکوالی بیا د HPLC-MS/MS لخوا لکه څنګه چې پورته تشریح شوی و معاینه شو.
ټول RNA د تولیدونکي لارښوونو سره سم د TRI ریجنټ (ترمو فشر) په کارولو سره د 10-12 تناسلي نسجونو یا د بدن نورو برخو (بې سر) څخه استخراج شو. RNA د TURBO DNase (ترمو فشر) سره درملنه وشوه. cDNA د تولیدونکي لارښوونو سره سم د Moloney murine leukemia ویروس ریورس ټرانسکرپټیس (M-MLV RT؛ ترمو فشر) په کارولو سره ترکیب شو. د ریورس ټرانسکرپشن کمیتي PCR (RT-qPCR؛ پراخ شوي ډیټا جدول 2) لپاره پرائمرونه دمخه خپاره شوي وو24 یا د پرائمر-BLAST26 په کارولو سره ډیزاین شوي وو، د 70-150 bp اندازې او د ایکسون-ایکسون جنکشنونو یا د پرائمر جوړه پرائمرونو جلا جلا ایکسونونو محصولاتو ته لومړیتوب ورکړل شوی و. د دریو څخه تر څلورو بیولوژیکي نقلونو څخه د cDNA نمونې د RT-qPCR لپاره په اوبو کې څلور ځله حل شوې وې. د مقدار ټاکل په 15 µl نقل تعاملاتو کې ترسره شو چې پکې 1× PowerUp SYBR شنه ماسټر مکس (ترمو فشر)، پرائمرونه، او 5 µl کم شوي cDNA شامل وو. عکس العملونه په a کې پرمخ وړل شوي د کوانټ سټوډیو 6 پرو ریښتیني وخت PCR سیسټم (ترمو فشر) او معلومات د ډیزاین او تحلیل (نسخه 2.4.3) په کارولو سره راټول او تحلیل شوي. لکه څنګه چې پدې څیړنه کې ښودل شوي، نسبي مقدارونه د ریبوسومل جین RpL19 (AGAP004422) ته نورمال شوي، چې څرګندونه یې د وینې تغذیه 27 یا د ملګرتیا 3 سره د پام وړ بدلون نه دی راغلی.
د RNA کیفیت د Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) په کارولو سره معاینه شو. د Illumina جوړه شوي پای کتابتونونه د MIT او هارورډ په براډ انسټیټیوټ کې چمتو او چلول شوي. د ترتیب لوستل د A. gambiae جینوم (PEST strain، نسخه 4.12) سره د HISAT2 (نسخه 2.0.5) په کارولو سره د ډیفالټ پیرامیټرو سره سمون درلود. د نقشې کیفیت (MAPQ) نمرو سره لوستل <30 د Samtools (نسخه 1.3.1) په کارولو سره لرې شوي. د جینونو سره نقشه شوي لوستلو شمیر د ډیفالټ پیرامیټرو سره د htseq-count (نسخه 0.9.1) په کارولو سره شمیرل شوی. د لوستلو نورمال شوي شمیرې محاسبه شوې او د R (نسخه 4.0.3) کې د DESeq2 پیکج (نسخه 1.28.1) په کارولو سره د توپیر جین څرګندونه تحلیل شوې.
د ایکډیسون-تعدیل کونکي جین نوماندان د لومړي ځل لپاره د PSI-BLAST الګوریتم (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) په کارولو سره د A. gambiae جینوم په لټون سره پیژندل شوي، د ډیفالټ ارزښتونو په کارولو سره د لاندې پوښتنې پروټین ترتیبونو سره پیرامیټرونه: د بومبیکس موري څخه (د ضمیمې شمیره NP_001038956.1)، مسکا ډومیسټیکا (د ضمیمې شمیره XP_005182020.1، XP_005175332.1 او XP_011294434.1) او مایکروپلایټس ډیمولیټر (د ضمیمې شمیره XP_008552646.1 او XP_008552645.1) EcK د B. موري څخه (د ضمیمې شمیره NP_001036900)، ډروسوفیلا میلانوګاسټر (د ضمیمې شمیره NP_651202)، اپیس میلیفیرا (د ضمیمې شمیره XP_394838) او ایکیرتوسیفون پیسم (د ضمیمې شمیره XP_001947166)؛ او د B. mori (د ضمیمې شمیره XP_001947166) NP_001177919.1 او NP_001243996.1) څخه EPP او د D. melanogaster (د ضمیمې شمیره NP_572986.1) EO (لومړی ګام). بیا، په ګمبیا کې د تولیدي نسج (ښځینه LRT یا MAG) کې د لوړ mRNA اظهار (>100 ټوټې/کیلوبیس ایکسون په هر ملیون نقشه شوي لوستلو (FPKM) یا >85٪) پراساس فلټر کوي (دوهم ګام). د ځانګړتیا د ښه کولو لپاره، موږ د نوماند انزایمونه غوره کړل چې د A. albimanus په تناسلي نسج کې هم څرګند شوي، د انوفیلس یو ډول چې د ملګرتیا پرمهال د ایکډیسون ترکیب یا لیږد نه کوي. د نوماند جینونه د A. albimanus تناسلي نسج (مرحله 3) کې د ټیټ اظهار (<100 FPKM یا <85th فیصده) پراساس فلټر شوي. د وروستي فلټر (مرحله 4) په توګه، د نوماند جینونه باید لږترلږه د لاندې څخه یو پوره کړي: (1) د ملګرتیا وروسته د پام وړ لوړ تنظیم شوی (P < 0.05) د توپیر لرونکي څرګند شوي جینونو تحلیل سره سم او (2) په غیر تناسلي نسجونو کې (<85٪ یا <100 FPKM).
موږ د ټول ارګانیزم د ایزوټوپیک لیبل کولو لپاره مخکې تشریح شوي میتودونه 28,29,30 تعدیل کړل. په لنډه توګه، وحشي ډول Saccharomyces cerevisiae ډول II (YSC2, Sigma) د خمیر نایتروجن اساس (BD Difco, DF0335) کې ازمول شوی و چې (wt/vol) 2٪ ګلوکوز (G7528, Sigma)، 1.7٪ امینو اسید فری او امونیم سلفیټ لري. کلتور منځنی) او 5٪ 15N امونیم سلفیټ (NLM-713, >99٪, کیمبرج آیسوټوپ لابراتوارونه) د نایتروجن یوازینۍ سرچینې په توګه. خمیر د سینټرفیوګیشن لخوا بیرته ترلاسه شو او د مچیو لاروا ته د پیوپیشن پورې د اشتها وړ خواړه ورکړل شول. د څلورم انسټار مړینې مخنیوي لپاره د کب غوښې سره ضمیمه (په 300 لاروا کې 0.5 ملی ګرامه). بیا یوازې ښځینه د غیر لیبل شوي نارینه وو سره د ملګرتیا تجربو کې کارول شوې ترڅو د ملګرتیا پرمهال لیږدول شوي نارینه پروټوم تحلیل کړي.
د ۴-۶ ورځو عمر لرونکي ۱۵N-ټګ شوي کنوارې ښځې اړ ایستل شوې چې د عمر سره سم نه ټګ شوي کنوارې نارینه وو سره ملګرتیا وکړي. د بریالي ملګرتیا تایید د ایپی فلوروسینس مایکروسکوپي لاندې د ملګرتیا پلګونو کشف کولو سره وشوه. په ۳، ۱۲، او ۲۴ hpm کې، د ۴۵-۵۵ ګډ شوي میرمنو ایټریا د ۵۰ µl امونیم بای کاربونیټ بفر (pH ۷.۸) کې ویشل شوې او د پیسټل سره همجنس شوې. هوموجنیټ سینټرفیوج شوی او سوپرنیټنټ د ۵۰ µl ۰.۱٪ ریپی ګیسټ (۱۸۶۰۰۱۸۶۰، واټرز) سره په ۵۰ mM امونیم بای کاربونیټ کې مخلوط شوی. د هرې نمونې څخه سوپرنیټنټ او ګولۍ په وچه یخ کې کنګل شوي او د شپې لخوا د واشنګټن پوهنتون کې د مک کاس لابراتوار ته لیږدول شوي، چیرې چې د LC-MS/MS لپاره د نمونې چمتووالی بشپړ شوی. ګولۍ د ۵۰ µl ۰.۱٪ ریپی ګیسټ په ۵۰ µl کې په ۵۰ mM کې بیا وځنډوئ. امونیم بای کاربونیټ او سونیکیټ په اوبو حمام کې. د ګولۍ او سوپرناټینټ پروټین غلظت د BCA ازموینې لخوا اندازه شو، نمونې د 5 ملي میتر ډیتیوتریټول (DTT؛ سیګما) سره کمې شوې، د 15 ملي میتر آیوډواسیټامایډ (سیګما) سره الکیلیټ شوې او د ټریپسینائزیشن سره د 1 ساعت لپاره په 37 °C (1:0 50) کې انکیوبیټ شوې: ټریپسین: سبسټریټ تناسب). ریپی ګیسټ د 200 ملي میتر HCl اضافه کولو سره لایز شوی، وروسته د 45 دقیقو لپاره په 37 °C کې انکیوبیشن او د 10 دقیقو لپاره په 4 °C کې په 14,000 rpm کې سنټرفیوګیشن د کثافاتو لرې کولو لپاره. نمونې د دوه ګوني حالت جامد مرحلې استخراج (Oasis MCX کارتوس، اوبه) لخوا مینځل شوې او د 0.33 µg µl-1 وروستي پروټین غلظت لپاره په 0.1٪ فارمیک اسید کې بیا ځړول شوې. بې لیبل شوي MAG پروټومونه په ورته ډول د ورجن نارینه وو څخه تحلیل شوي. دوه د هرې نمونې لپاره تحلیلي نقلونه تحلیل شول. بیا، د هر یو 1 µg د 25 سانتي مترو فیوز شوي سیلیکا 75-μm ستون په کارولو سره تحلیل شو چې د 4 سانتي مترو فیوز شوي سیلیکا کاسیل 1 (PQ) فریټ ټریپ سره د مشتري C12 ریورسډ فیز رال (فینومینیکس) او 180 دقیقو مایع کروماتګرافي سره ډک شوی و. د نمونې هضمونه - MS/MS د Q-Exactive HF ماس سپیکٹرومیټر (Thermo Fisher) په واسطه د نانو ACQUITY UPLC سیسټم (Waters) سره چلول شوي. د هر رن لپاره رامینځته شوي د معلوماتو پورې اړوند استملاک ډیټا د پروټیوویزارډ (نسخه 3.0.20287) په کارولو سره او د Comet31 (نسخه 3.2) په کارولو سره د FASTA ډیټابیس په مقابل کې بدل شوي چې د انوفیلس ګمبیا (ویکټربیس نسخه 54)، انوفیلس کولوزی څخه د پروټین ترتیبونه لري. په Mali-NIH (ویکټربیس نسخه 54)، Saccharomyces cerevisiae (Uniprot، مارچ 2021)، A. gambiae RNA-seq، او د پیژندل شوي انساني ککړونکو درې چوکاټ ژباړې کې لټون ترسره شو. د پیپټایډ نقشې سره سمون لرونکي FDRs د Percolator32 (نسخه 3.05) په کارولو سره د 0.01 حد سره ټاکل شوي، او پیپټایډونه په Limelight33 کې د پروټین پارسیموني په کارولو سره د پروټین پیژندنې ته راټول شوي. (نسخه 2.2.0). د پروټین نسبي کثرت د نورمال شوي طیفي کثرت فکتور (NSAF) په کارولو سره اټکل شوی و چې د هر پروټین لپاره په هر رن کې محاسبه شوی لکه څنګه چې مخکې تشریح شوی. د هر پروټین په پرتله NSAF د دوه مختلف بیولوژیکي نقلونو څخه نمونو کې اوسط شوی و. 15N لیبل کول په بریالیتوب سره ښځینه پروټوم ماسک کړ، که څه هم د لیبل شوي کنوارو څخه د غیر لیبل شوي پروټین لږ مقدار کشف کیدی شي. موږ د ښځینه خام نمونو کې د نارینه پروټین کمښت (1-5 سپیکٹرا) کشف یوازې په تخنیکي منډو کې ثبت کړ، چیرې چې خام نمونې د نارینه / ملګرې نمونو وروسته چلول شوي، د HPLC "کیري اوور" په پایله کې. کله ناکله پروټینونه چې د لیبل شوي کنوارو څخه د 'ککړونکو' په توګه موندل شوي په ضمیمه جدول 1 کې لیست شوي دي.
په جین سکریپټ کې دوه انټيجنیک پیپټایډونه، QTTDRVAPAPDQQQ (د آیسوټائپ PA دننه) او MESDGTTPSGDSEQ (د آیسوټائپ PA او PB دننه). دوه پیپټایډونه یوځای شوي، بیا د کیریر پروټین KLH سره یوځای شوي او د نیوزیلینډ خرگوش ته داخل شوي. خرگوش د څلورم انجیکشن وروسته قرباني شوي، او ټول IgG د اتصال پاکولو له لارې جلا شوی. د EPP ځانګړي خرگوش څخه IgG د نورو لویدیځ بلوټینګ لپاره کارول شوی و.
د لویدیځو بلاټونو لپاره، MAG (n = 10، چیرې چې n د بیولوژیکي پلوه خپلواک مچیو نمونو شمیر استازیتوب کوي) او ښځینه LRT (n = 30) د 4 ورځو زاړه نارینه او کنوارې یا په زور سره یوځای شوي ښځینه (<10 د ملګرتیا وروسته)، د پروټین استخراج بفر (50 mM Tris، pH 8.0؛ 1٪ NP-40؛ 0.25٪ سوډیم ډیوکسیکولیټ؛ 150 mM NaCl؛ 1 mM EDTA؛ 1× پروټیز مخنیوی کوکټیل (روش)) په جلا توګه اضافه شو. نمونې د بیډر سره د تحلیل وروسته سمدلاسه همجنس شوي (2 ملي میتر شیشې مڼې، 2,400 rpm، 90 ثانیې). د نه حل کیدونکي کثافاتو د 20,000 ګرامه په 4 °C کې د سینټرفیوګیشن لخوا لرې شوي. پروټینونه د براډفورډ ازموینې (بایو-راډ) لخوا اندازه شوي. بیا، 20 µg MAG پروټین، 40 µg LRT پروټین، او 20 د پاتې شونو بلک پروټین µg د MOPS بفر په کارولو سره د 10٪ Bis-Tris NuPAGE لخوا تخریب او جلا شول. پروټینونه د iBlot2 لیږد سیسټم (ترمو فشر) په کارولو سره پولی وینیلایډین فلورایډ غشا ته لیږدول شوي. غشاګانې په 1× PBS-T (0.1٪ Tween-20 په PBS کې) کې دوه ځله مینځل شوي او بیا د 1 ساعت لپاره په 22 درجو سانتي ګراد کې د اوډیسي بلاک کولو بفر (Li-Cor) کې بند شوي. غشاګانې د شپې په 4 درجو سانتي ګراد کې د دودیز خرگوش ضد EPP پولی کلونل لومړني انټي باډي (1:700 په بلاک کولو بفر کې) او د موږک ضد ایکټین مونوکلونل لومړني انټي باډي MAC237 (Abeam؛ 1:4,000) سره ولړزول شوې. غشاګانې د PBS-T سره مینځل شوي او بیا د ثانوي انټي باډیز (د خره ضد 800CW او د وزې ضد موږک 680LT (Li-Cor) سره انکیوب شوي، دواړه 1:20,000) په بلاک کولو بفر کې چې 0.01٪ SDS لري او 0.2٪ Tween -20 د 1 ساعت لپاره په 22 درجو سانتي ګراد کې. غشاګانې د PBS-T سره مینځل شوي او د اوډیسي CLx سکینر سره عکس اخیستل شوي. انځورونه د عکس سټوډیو (نسخه 5.2) کې راټول شوي او پروسس شوي. د EPP-RA isoform (82 kDa) سره مطابقت لرونکی ځانګړی بانډ ونه موندل شو.
د EPP د کوډ کولو سیمې (لکه د ایزوفارم AGAP002463-RB په توګه چې د هسټیډین فاسفیټیس ډومین لري، د NCBI ساتل شوي ډومین لټون 34) او EcK2 (AGAP002181) په pET-21a(+) پلازمیډ (نواګین ملیپور سیګما) کې کلون شوي؛ پرائمرونه په پراخ شوي معلوماتو جدول 2 کې لیست شوي دي. اته GS4 لینکرونه (په ټنډم کې) د pET-21a(+)-EcK2 جوړښت د C-ټرمینل 6xHis ټګ څخه مخکې داخل شوي وو. بیا جوړونکي پروټینونه د NEBExpress حجرو څخه پاک E. coli پروټین ترکیب غبرګون (نیو انګلینډ بایو لیبز) په کارولو سره تولید شوي. بیا جوړونکي پروټینونه د NEBExpress Ni spin columns (نیو انګلینډ بایو لیبز) په کارولو سره پاک شوي. د ډای هایدروفولیټ ریډکټیس (DHFR) کنټرول پروټین د NEBExpress حجرو څخه پاک E. coli پروټین ترکیب کټ څخه د DNA ټیمپلیټ په کارولو سره تولید شوی. پروټینونه د PBS په 50٪ ګلیسیرول کې د -20 °C په تودوخه کې تر 3 میاشتو پورې زیرمه شوي وو.
د EPP او نسجونو استخراج د فاسفیتس فعالیت د 4-نایتروفینیل فاسفیټ (pNPP؛ سیګما-الډریچ) په کارولو سره اندازه شو. د تعامل بفر کې 25 mM Tris، 50 mM acetic acid، 25 mM Bis-Tris، 150 mM NaCl، 0.1 mM EDTA، او 1 mM DTT شامل وو. نسج د تعامل بفر کې همجنس شوی و او د حجرو کثافات د سینټرفیوګیشن له لارې لرې شوي وو. د تعامل بفر ته د انزایم یا نسج استخراج اضافه کولو سره تعامل پیل کړئ چې 2.5 mg ml-1 pNPP لري. د تعامل مخلوط په تیاره کې د خونې په تودوخه کې انکیوبیټ شوی و، او د pNPP څخه بدل شوي pNP اندازه په مختلفو وختونو کې د 405 nm جذب اندازه کولو سره اندازه شوې وه.
د ان ویټرو EcK فعالیت لپاره، پروټین د 0.2 mg 20E یا 3D20E سره په 200 µl بفر (pH 7.5) کې انکیوبیټ شوی و چې 10 mM HEPES–NaOH، 0.1٪ BSA، 2 mM ATP او 10 mM MgCl2 پکې شامل وو د 2 ساعتونو لپاره په 27 °C کې. تعامل د 800 µl میتانول اضافه کولو سره ودرول شو، بیا د 1 ساعت لپاره -20 °C کې سړه شو، بیا په 4 °C کې د 10 دقیقو لپاره په 20,000 g کې سینټرفیوج شو. بیا سوپرنټینټ د HPLC-MS/MS لخوا تحلیل شو. د کنټرول ګروپ کې کارول شوي پروټینونو د تودوخې غیر فعالولو لپاره، پروټینونه په 95 °C کې د 20 دقیقو لپاره په PBS کې په 50٪ ګلیسیرول کې انکیوبیټ شوي وو.
د ان ویټرو EPP فعالیت لپاره، پروټین د 3D20E22P سره انکیوبیټ شو (د MAG په 18 جوړه کې موندل شوي مقدار سره مساوي، د HPLC-MS/MS لخوا پاک شوی) په 100 µl بفر (pH 7.5) کې چې 25 mM Tris، 50 mM اسټیک اسید، 25 mM Bis-Tris، 150 mM NaCl، 0.1 mM EDTA، او 1 mM DTT پکې شامل وو د 3 ساعتونو لپاره په 27 °C کې. تعامل د 400 µl میتانول اضافه کولو سره ودرول شو او د 1 ساعت لپاره -20 °C کې سړه شو، بیا په 20,000 g کې د 10 دقیقو لپاره په 4 °C کې سینټرفیوج شو. سوپرنټینټ د HPLC-MS/MS لخوا تحلیل شو.
د EPP (362 bp)، EcK1 (AGAP004574، 365 bp) او EcK2 (556 bp) لپاره د PCR ټوټې د مخلوط جنس پرته د سر لرونکي مچیو مړو څخه چمتو شوي cDNA څخه پراخه شوې. د eGFP کنټرول (495 bp) د PCR ټوټې د مخکې تشریح شوي pCR2.1-eGFP څخه پراخه شوې؛ د PCR پرائمرونه په غزیدلي معلوماتو جدول 2 کې لیست شوي دي. د PCR ټوټه د pL4440 پلازمیډ کې د التهاب شوي T7 پروموټرونو ترمنځ داخل شوې وه. د پلازمیډ جوړښتونه د NEB 5-α وړ E. coli (نیو انګلینډ بایولابس) څخه ترلاسه شوي او د کارولو دمخه د DNA ترتیب لخوا تایید شوي (د داخلولو ترتیب لپاره ضمیمه ډیټا 1 وګورئ). د T7 پروموټر سره سمون لرونکي پرائمرونه (د پراخ شوي ډیټا جدول 2) د pL4440 پر بنسټ پلازمیډ څخه د داخلولو د پراخولو لپاره کارول شوي. د PCR محصول اندازه د اګروز جیل الیکټروفوریسس لخوا تایید شوې. dsRNA د میګا سکریپټ T7 ټرانسکرپشن کټ (ترمو فشر) په کارولو سره د PCR ټیمپلیټونو څخه لیکل شوی او د جوړونکي لارښوونو سره سم د مخکې تشریح شوي تعدیلاتو سره پاک شوی.
د dsRNA انجیکشن لپاره، د 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 ng nl-1 غلظت سره د بالغ نارینه یا ښځینه (Nanoject III, Drummond) په سینه کې د 10 ng nl-1 غلظت سره د 1 ورځې په اوږدو کې د Eclosion وروسته انجیکشن شو. د جین د ټکولو کچه د RNA استخراج، cDNA ترکیب، او RT-qPCR لخوا لږترلږه په دریو بیولوژیکي نقلونو کې ټاکل شوې وه. د ایکډیسون انجیکشن لپاره، د 4 ورځو کنوارې یا 6 ورځو کنوارې وینې تغذیه شوي میرمنې د 0.13، 0.21، یا 0.63 µg 20E یا 3D20E (Nanoject III, Drummond) سره په ترتیب سره د 1.3، 2.1 غلظت سره انجیکشن شوې، د تجربوي ډیزاین یا 6.3 ng nl-1 پورې اړه لري. د 100 nl 10٪ (vol/vol) ایتانول انجیکشن کړئ. په اوبو کې؛ په 10٪ ایتانول کې د 3D20E22P 100 nl (د MAGs په جوړه کې موندل شوي مقدار 75٪ سره مساوي). مچان په ناڅاپي ډول د انجیکشن ګروپ ته ګمارل شوي وو.
د هګیو د هګیو د تشخیص لپاره، د 3 ورځو عمر لرونکو ښځینه وو ته د انسان په وینه کې په بشپړ ډول تغذیه شوې وه. په جزوي ډول تغذیه شوي یا نه تغذیه شوي مچۍ لرې کړئ. د درملنې پورې اړه لري، ښځینه وو ته د وینې له خوړلو وروسته لږترلږه 48 ساعته د څلورو شپې لپاره په جلا هګیو کې ځای پر ځای شوي وو. هګۍ د سټیریوسکوپ لاندې شمیرل شوي (Stemi 508، Zeiss)؛ د ګډو ښځینه وو لپاره، هغه هګۍ چې لاروا ته راوتلي وي زرغون ګڼل کیدې.
د جنسي آزموینو لپاره، ښځینه وو ته د درملنې پورې اړه لري چې د جنسي مقاومت رامینځته کړي، او د وحشي ډول عمر سره سمون لرونکي نارینه وو ته وروسته په ورته پنجره کې معرفي شول. دوه شپې وروسته، د ښځینه القاح شوي ویسیکلونه پرې شول او جینومیک DNA د فریز-تو او سونیکیشن له لارې په یوه بفر کې خوشې شو چې پکې 10 mM Tris-HCl، 1 mM EDTA، او 25 mM NaCl (pH 8.2) شامل وو. نمونې د پروټینیز K (0.86 µg µl-1) سره د 15 دقیقو لپاره په 55 °C کې، وروسته 10 دقیقې په 95 °C کې انکیوبیټ شوې. خام جینومیک DNA چمتووالی 10 ځله کم شوی او د Y کروموزوم ترتیبونو qPCR کشف سره مخ شوی؛ پرائمرونه په غزیدلي معلوماتو جدول 2 کې لیست شوي دي. د Y کروموزوم ترتیب نشتوالی د هیڅ ډول ملګرتیا ښودنه کوي.
د بیا یوځای کیدو د معاینې لپاره، په زور سره یوځای شوي میرمنې د یوځای کیدو پلګونو شتون لپاره معاینه شوې ترڅو د یوځای کیدو حالت تایید کړي او دوه ورځې یې اجازه ورکړه چې د نارینه وو په نشتوالي کې د یوځای کیدو لپاره انعکاسي رامینځته کړي، لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي 36. هغه نارینه چې د DsRed ټرانسجینک سپرم لیږدوي بیا د ښځینه پنجرو ته معرفي شول. دوه شپې وروسته، د القاح کولو ویسیکلونه د ښځینه وو څخه جلا شول، او جینومیک DNA چمتو شو لکه څنګه چې پورته تشریح شوی او د DsRed ټرانسجین د qPCR کشف سره مخ شو؛ پرائمرونه په غزیدلي معلوماتو جدول 2 کې لیست شوي دي. د DsRed ټرانسجین نشتوالي ښودلې چې بیا یوځای کیدل نه دي پیښ شوي.
3D20E د مخکې تشریح شوي 37 په څیر ترکیب شوی و. په لنډه توګه، د 20E (سیګما-الډریچ) 10 ملی ګرامه په 10 ملی لیتر اوبو کې حل شو، وروسته د 30 ملی ګرامه پلاټینیم تور (د پوډر په بڼه، سیګما-الډریچ) اضافه شو. د O2 یو نرم جریان په دوامداره توګه د تعامل مخلوط ته بلبل شو، کوم چې د خونې په حرارت کې ودرول شو. د 6 ساعتونو وروسته، د تعامل بندولو لپاره 30 ملی لیتر میتانول اضافه شو. مخلوط د کتلست ذرات لرې کولو لپاره سنټرفیوج شو. سپرنټینټ د خونې په حرارت کې په خلا کې وچوالي ته تبخیر شو. د وچ شوي تعامل محصول د HPLC-MS/MS تحلیل لپاره د انجیکشن لپاره په 10٪ ایتانول او میتانول کې حل شو. د تبادلې کچه (له 20E څخه تر 3D20E پورې) نږدې 97٪ وه (انځور 4b)، او د ترکیب شوي 3D20E MS سپیکٹرم د هغه څه سره سمون درلود چې په جوړه شوې میرمنو کې موندل شوي (انځور 4c).
دا افسانه د ترسره شویو احصایوي ازموینو ځانګړي توضیحات لري. ګراف پیډ (نسخه 9.0) د فشر دقیق ازموینې، مانټل-کاکس ازموینې، او د زده کونکي د ټي ازموینې ترسره کولو لپاره کارول شوی و. د کوچران-مانټل-هاینزیل ازموینې د دودیز R سکریپټ په کارولو سره ترسره شوې (په https://github.com/duopeng/mantelhaen.test کې شتون لري). د معلوماتو ویش د شاپیرو-ویلک ازموینې په کارولو سره د 0.05 د اهمیت حد سره د نورمالیت لپاره ازمول شوی و. کله چې معلومات د نورمالیت ازموینې کې ناکام شول، د مان-ویټني ازموینه ترسره شوه. د بقا معلومات د مانټل-کاکس ازموینې په کارولو سره تحلیل شوي. د DESeq2 کڅوړه (نسخه 1.28.1) د RNA-seq جین کچې توپیر څرګندولو تحلیل ترسره کولو لپاره کارول شوې وه. په ګراف کې افقی بار د میډین استازیتوب کوي. د P = 0.05 اهمیت ارزښت د ټولو ازموینو لپاره د حد په توګه کارول شوی و.
د مطالعې ډیزاین په اړه د نورو معلوماتو لپاره، د طبیعت څیړنې راپور لنډیز وګورئ چې د دې مقالې سره تړاو لري.
د MS پروټومیک معلومات د PRIDE پارټنر ریپوزټري (https://www.ebi.ac.uk/pride/) له لارې د ډیټاسیټ پیژندونکي PXD032157 سره د پروټوم ایکس چینج کنسورشیم (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ته زیرمه شوي.
د RNA-seq ډیټاسیټ د جین ایکسپریشن جامع کتابتون (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) کې د سیریل ریکارډ GSE198665 لاندې زیرمه شوی.
د اوسني مطالعې په جریان کې تولید شوي او/یا تحلیل شوي اضافي ډیټاسیټونه ممکن د اړوندو لیکوالانو څخه د مناسب غوښتنې په صورت کې ترلاسه شي. دا مقاله د سرچینې معلومات چمتو کوي.
ډی لوف، اې. ایکډیسټرایډز: د حشراتو د جنسي سټرایډونو له پامه غورځول شوي؟ نارینه: تور بکس. د حشراتو ساینس. ۱۳، ۳۲۵-۳۳۸ (۲۰۰۶).
ریډفرن، CPF 20-هایډروکسی ایکډیسون او د تخمدان وده په انافیلز سټیفنز کې. J. د حشراتو فزیولوژي.28، 97-109 (1982).