د حجرو د برخې کولو او هومیوستاسیس ساتلو لپاره د پټولو لارې کې د پروټین ترتیب کول اړین دي. د شیل-منځګړیتوب ترتیب کولو سربیره، د پټولو لیږد په پروسه کې د کاینسین ترتیب کولو کې د لیپیدونو رول یوه اوږدمهاله اساسي پوښتنه ده چې لا تر اوسه ځواب نه دی ورکړل شوی. دلته، موږ د 3D یوځل څو رنګه لوړ ریزولوشن ریښتیني وخت امیجنگ ترسره کوو ترڅو په ویوو کې ثابت کړو چې نوي ترکیب شوي ګلایکوسیلفاسفاټیډیلینوسیتول-غیر فعال پروټینونه د ډیر اوږد سیرامایډ لیپید برخې سره کلستر شوي او په ځانګړي انډوپلازمونو کې طبقه بندي شوي دي د خالص وتلو سایټ، کوم چې د ټرانس میمبرین پروټینونو لخوا کارول شوي څخه توپیر لري. برسېره پردې، موږ ښیې چې د انډوپلازمیک ریټیکولم جھلی کې د سیرامایډ زنځیر اوږدوالی د دې ترتیب کولو انتخاب لپاره خورا مهم دی. زموږ مطالعه د لیپید زنځیر اوږدوالي پراساس د پروټین کارګو طبقه بندي کولو لپاره لومړی مستقیم انډوپلازمیک شواهد چمتو کوي چې د پټولو لارې کې په انتخابي صادراتو سایټونو کې.
په یوکاریوټیک حجرو کې، هغه پروټینونه چې په انډوپلازمیک ریټیکولم (ER) کې ترکیب شوي دي بیا د ترانسپورت په جریان کې د محرم لارې له لارې د دوی مناسب حجروي منزل ته د رسولو لپاره ترتیب کیږي (1). د کوټ-منځګړیتوب ترتیب کولو سربیره، دا له اوږدې مودې راهیسې اټکل کیده چې ځینې لیپیدونه کولی شي د ځانګړو غشا ډومینونو کې د کلستر کولو له لارې د انتخابي وتلو نقطو په توګه هم کار وکړي چې ځانګړي پروټینونه (2-5). په هرصورت، لاهم د دې ممکنه لیپید پر بنسټ میکانیزم ثابتولو لپاره د مستقیم ان ویوو شواهدو نشتوالی شتون لري. د دې اساسي ستونزې د حل لپاره، موږ په خمیر کې مطالعه وکړه چې څنګه ګلایکوسیلفاسفاټیډیلینوسیتول (GPI) لنگر شوي پروټینونه (GPI-APs) په جلا توګه د ER څخه صادر کیږي. GPI-APs د لیپید سره وصل شوي حجرو سطحې پروټینونو ډولونه دي (6، 7). GPI-AP یو پټ شوی پروټین دی چې د ګلایکولیپیډ moiety (GPI لنگر) له لارې د پلازما غشا بهرنۍ پاڼو سره وصل دی. دوی د GPI لنگرونه د ER lumen کې د ژباړې وروسته محافظه کار تعدیلاتو په توګه مني (8). د نښلولو وروسته، GPI-AP د ګلګي اپریټس (5، 9) له لارې د ER څخه پلازما غشا ته تیریږي. د GPI لنگرونو شتون د دې لامل کیږي چې GPI-AP د ټرانس میمبرین پټ شوي پروټینونو (د نورو پلازما جھلی پروټینونو په شمول) څخه د پټونکي لارې په اوږدو کې جلا شي (5، 9، 10). په خمیر حجرو کې، GPI-APs د انډوپلازمیک ریټیکولم کې د نورو پټ شوي پروټینونو څخه جلا کیږي، او بیا په ځانګړي ویسیکلونو کې بسته کیږي چې د کوټ پروټین کمپلیکس II (COPII) لخوا پوښل شوي (6، 7). د ER صادرولو پروسې کې د دې طبقه بندي پروسې ټاکونکي روښانه ندي، مګر اټکل کیږي چې دا میکانیزم ممکن لیپیدونو ته اړتیا ولري، په ځانګړي توګه د GPI لنگر د لیپید برخې ساختماني بیا رغونه (5، 8). په خمیر کې، د GPI لیپید بیا رغونه د GPI سره نښلولو وروسته سمدلاسه پیل کیږي، او په ډیری مواردو کې، دا د سیرامایډ د 26-کاربن اوږد زنځیر سنتر شوي غوړ اسید (C26:0) (11، 12) سره تړلو لامل کیږي. C26 سیرامایډ تر دې دمه د خمیر حجرو لخوا تولید شوی اصلي سیرامایډ دی. دا په ER کې ترکیب شوی او ډیری یې د COPII ویسیکلونو له لارې ګولګي اپریټس ته صادریږي (13). د GPI-AP د ER صادرات په ځانګړي ډول د سیرامایډ دوامداره ترکیب ته اړتیا لري (14، 15)، او په پایله کې، د ګولګي اپریټس کې د انوسیتول فاسفیټ سیرامایډ (IPC) ته د سیرامایډ بدلون د GPI لنگر ترکیب پورې اړه لري (16). د مصنوعي غشا سره بایو فزیک مطالعاتو ښودلې چې ډیر اوږد اسیل چین سیرامایډونه کولی شي د ځانګړي فزیکي ملکیتونو سره ترتیب شوي ډومینونو جوړولو لپاره سره یوځای شي (17، 18). دا معلومات دې فرضیې ته لار هواروي چې C26 سیرامایډ او GPI-AP د C26 سیرامایډ سره خپل فزیکي ملکیتونه کاروي ترڅو په نسبتا ګډوډ ER جھلی لیپید چاپیریال کې په منظم سیمو یا سیمو کې سره یوځای شي. دا په عمده توګه د لنډ او غیر مشبوع ګلیسیرولیپیډونو څخه جوړ شوی دی (C16:1 او C18:1) (19، 20). دا سیمې به په انتخابي ډول د ځانګړو ER وتلو ځایونو (ERES) باندې متمرکزې وي، چیرې چې سیرامایډ او سیرامایډ پر بنسټ GPI-AP کولی شي په ورته وقف شوي COPII ویسیکل (5) کې ګلګي ته په ګډه لیږدول شي.
په دې څیړنه کې، موږ د سوپر ریزولوشن کنفوکل ریئل ټایم امیجینګ مایکروسکوپي (SCLIM) په کارولو سره د لیپید پر بنسټ میکانیزم په مستقیم ډول ازموینه کړې، کوم چې د مایکروسکوپي یو عصري تخنیک دی چې کولی شي په ورته وخت کې د فلوروسینټ لیبل شوي پروټینونه مشاهده کړي. درې رنګه او درې بعدي (3D) انځورونه په ژوندیو حجرو کې خورا لوړ ریزولوشن او سرعت لري (21، 22).
موږ لومړی د SCLIM ټیکنالوژۍ څخه کار واخیست ترڅو نور تعریف کړو چې څنګه د C26 سیرامایډ ګروپ سره نورمال GPI-AP د S. cerevisiae کې د ER پریښودو وروسته د ټرانس میمبرین پټ شوي پروټینونو څخه سکرین شوی و. د ER طبقه بندي چک کولو لپاره، موږ یو جینیاتي سیسټم وکاراوه چې کولی شي په مستقیم ډول د نوي ترکیب شوي کارګو لیدلو لپاره چې په VIVO کې ERES ته ننوځي (7، 23). د کارګو په توګه، موږ د C26 سیرامایډ پر بنسټ GPI-AP Gas1 غوره کړ چې د شنه فلوروسینټ پروټین (GFP) سره لیبل شوی او د ټرانس میمبرین پټ شوی پروټین Mid2 د نږدې انفراریډ فلوروسینټ پروټین (iRFP) سره لیبل شوی، چې دواړه د پلازما جھلی په نښه کوي (24-26). په sec31-1 د تودوخې حساس میوټینټ کې، دا دوه کارګو د ګالکټوز-انډیکیبل پروموټر او د جوړونکي ERES مارکر لاندې څرګند شوي. په خورا تودوخې (37°C) کې، ځکه چې sec31-1 بدلون د COPII کوټ اجزا Sec31 فعالیت اغیزه کوي ترڅو د COPII ټوکیدنه او ER صادرات منع کړي، نوي ترکیب شوي کارګو په ER (23) کې راټولیږي. د ټیټې تودوخې (24 درجو سانتي ګراد) ته د سړېدو وروسته، د sec31-1 میوټینټ حجرات د پټونکي ساحې څخه بیرته راستانه شول، او راټول شوي نوي مصنوعي کارګو د ER څخه صادرول پیل شول. د CLIM لید ښودلې چې ډیری نوي ترکیب شوي Gas1-GFP او Mid2-iRFP لاهم د sec31-1 میوټینټ حجرو په ER کې د 37 درجو سانتي ګراد کې د انکیوبیشن وروسته راټول شوي او بیا د 5 دقیقو لپاره په 24 درجو سانتي ګراد کې خوشې شوي (شکل 1). څرنګه چې Mid2-iRFP په ټول ER جھلی ویشل شوی، او Gas1-GFP متمرکز دی او په غیر متمرکز ER جھلی ساحه کې راټول شوی، د دوی ویش په بشپړ ډول توپیر لري (شکل 1، A څخه C او فلم S1). سربیره پردې، لکه څنګه چې په شکل 1D کې ښودل شوي، د Gas1-GFP کلستر Mid2-iRFP نلري. دا پایلې ښیي چې GPI-AP او ټرانس میمبرین پروټینونه په پیل کې په مختلفو ER جھلی سیمو کې جلا شوي وو. د Gas1-GFP کلستر د یو ځانګړي ERES سره نږدې دی چې د mCherry د COPII کوټ پروټین Sec13 سره لیبل شوی (شکل 1، E او F، او فلم S1) (23).
sec31-1 حجرات د ګالکټوز هڅول شوي سرایتونه، د اوږدې اسیل زنځیر (C26) سیرامایډ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP، شنه) او د ټرانس میمبرین پروټین Mid2-iRFP (TMP، نیلي) څرګندوي او دا ساختماني ERES لیبل کول Sec13-mCherry (ERES، میجنټا) د 30 دقیقو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ شوی و، 24 درجو سانتي ګراد ته لیږدول شوی و، او 5 دقیقې وروسته د SCLIM لخوا انځور شوی و. (A څخه C) د الوتکې (A) یو استازی یوځای شوی یا واحد 2D انځور، د 10 z- برخو (B) 2D پروجیکشن انځور یا د کارګو او ERES مارکرونو (C) د 3D حجرو نیمه کره انځور ښیي. د پیمانه بار 1μm (A او B). د پیمانه واحد 0.551μm (C) دی. Gas1-GFP په جلا ER سیمو یا کلسترونو کې کشف او توزیع شوی و، پداسې حال کې چې Mid2-iRFP د ER جھلی (C) په اوږدو کې کشف او ویشل شوی و. (D) ګراف د سپینې تیرې کرښې (کیڼ اړخ) په اوږدو کې د Gas1-GFP کلستر کې د Gas1-GFP او Mid2-iRFP نسبي فلوروسینس شدت ښیې. AU، خپل سري واحد. (E او F) د 3D انځور استازیتوب کوي چې توکي او ERES نښه سره یوځای کوي. د Gas1-GFP کلسترونه د ځانګړي ERES ته نږدې کشف شوي. د پیمانه واحد 0.551μm دی. (F) سپین جامد تیر د ERES سره تړلي د Gas1-GFP کلستر په نښه کوي. منځنۍ او ښي پینلونه یوځای شوي لوی شوي 3D انځور او د غوره شوي Gas1-GFP کلستر یو څرخیدونکی لید ښیې.
د Gas1-GFP کلستر او یو ځانګړي ERES ترمنځ نږدې فضايي اړیکه ښیي چې Gas1-GFP کولی شي انتخابي ERES ته ننوځي، کوم چې د Mid2-iRFP لخوا د ER پریښودو لپاره کارول شوي انتخابي څخه توپیر لري. د دې امکان د حل کولو لپاره، موږ د ERES تناسب یوازې د یو یا دوه توکو لپاره اندازه کړ (شکل 2، A څخه C). موږ وموندله چې ډیری ERES (70٪) یوازې یو ډول کارګو لري. د شکل 2C لاندې انځور د ERES دوه ځانګړي مثالونه ښیې چې یوازې Gas1-GFP (شکل 1) یا یوازې Mid2-iRFP (شکل 2) لري. برعکس، د ERES نږدې 20٪ دوه کارګو لري چې په ورته ساحه کې سره یوځای کیږي. دا وموندل شوه چې ځینې ERES (10٪) دوه ډوله کارګو لري، مګر دوی په روښانه توګه په مختلفو سیمو کې جلا شوي. له همدې امله، دا احصایوي تحلیل ښیي چې د ER صادرولو وروسته، GPI-AP Gas1-GFP او د ټرانس میمبرین کارګو Mid2-iRFP په مختلفو ERES ویشل شوي (شکل 2D). د دې ترتیب کولو موثریت د تیرو بایو کیمیکل تحلیل (6) او مورفولوژیکي تعیین (7) سره خورا مطابقت لري. موږ کولی شو د قرنطین شوي کارګو چلند هم وګورو چې ERES ته ننوځي (شکل 2E او فلم S2). شکل 2E ښیې چې د Gas1-GFP (پینل 3) یا Mid2-iRFP (پینل 4) یوازې یوه کوچنۍ برخه له یوې خوا څخه ERES ته ننوځي او په یوه جلا سیمه کې محدوده ده. د شکل 2E پینل 5 ښیې چې Gas1-GFP او Mid2-iRFP ځینې وختونه په ورته ERES کې موندل کیږي، مګر دوی له مختلفو خواوو څخه ننوځي او په جلا سیمو کې متمرکز دي چې ممکن د مختلف COPII ویسیکلونو استازیتوب وکړي. موږ دا هم تایید کړه چې د C26 سیرامایډ پر بنسټ GPI-AP Gas1 لیدل شوی جلا کول او طبقه بندي د انتخابي ERES په توګه مشخص دي ځکه چې د بل ټرانس میمبرین سرایت کارګو، د GFP ټګ شوی پلازما میمبرین پروټین Axl2 (27)، د Mid2-iRFP سره ورته چلند ښیې. (انځور S1 او فلم S3). نوی ترکیب شوی Axl2-GFP د ER غشا له لارې ویشل شوی لکه Mid2-iRFP (شکل S1، A او B)، او په ډیری ERES کې د Mid2-iRFP سره یوځای ځای پر ځای شوی دی (شکل S1، B څخه تر D پورې). د شکل 1 پینل 1 او 2. S1C د ERES دوه ځانګړي مثالونه ښیې چیرې چې دوه ټرانس میمبرین کارګو یو بل سره یوځای کیږي. پدې قضیو کې، دواړه توکي ERES ته یوځای ننوځي (شکل S1E، پینل 3 او فلم S3).
د sec31-1 حجرې چې د ګالکټوز انډیکیبل سرایت څرګندوي، Gas1-GFP (GPI-AP، شنه) او Mid2-iRFP (TMP، نیلي) او د Sec13-mCherry (ERES، میجنټا) لیبل کولو جوړښتي ERES په 37 کې ځای په ځای شوي وو د 30 دقیقو لپاره په °C کې د انکیوبیشن وروسته، د سرایت بلاک خوشې کولو لپاره 24 °C ته لاړ شئ، او د 20 دقیقو وروسته د SCLIM سره عکس واخلئ. (A څخه C) د کارګو او 10 z- برخو استازیتوب 2D پروجیکشن انځورونه (A؛ پیمانه بار، 1μm) یا د 3D حجرو نیمه کره انځورونه (B او C؛ پیمانه واحد، 0.456μm) د ERES لخوا نښه شوي. په (B) کې ښکته پینل او په (C) کې پینل پروسس شوي انځورونه ښیې ترڅو یوازې په ERES (میجنټا) کې موجود توکي وښیې [Gas1-GFP (خړ) او Mid2-iRFP (روښانه نیلي)]. (ج) خلاص غشی: ERES یوازې د کارګو یوه ټوټه لیږدوي (۱ څخه تر ۴ پورې). خړ غشی: ERES جلا شوی کارګو لري (۵). سپین جامد غشی: ERES چې ګډ موقعیت لري کارګو لري. لاندې: غوره شوی واحد ERES یوازې Gas1-GFP (۱) یا Mid2-iRFP (۲) لري. د پیمانه بار، ۱۰۰ نانومیټر. (د) د فوتو مایکروګراف اندازه کول چې په (C) کې تشریح شوي. د ERES اوسط سلنه چې یوازې یو کارګو لري (Gas1-GFP یا Mid2-iRFP)، جلا شوی کارګو او اوورلیپینګ کارګو. په دریو خپلواکو تجربو کې، په ۵۴ حجرو کې n=۴۳۲. د خطا بار = SD. دوه لکۍ بې جوړې t ازموینه. *** P = 0.0002. (E) د قرنطین شوي کارګو د ټاکل شوي ERES 3D عکس چې د (C) سره نښه شوی. Gas1-GFP (شنه) (۳) یا Mid2-iRFP (نیلي) (۴) له یوې خوا څخه ERES (میجنټا) ته ننوځي او د ERES دننه یوې کوچنۍ سیمې ته محدود دی. ځینې ​​وختونه، دواړه ډوله بارونه له ورته اړخ څخه ورته ERES (5) ته ننوځي او د ERES دننه یوې جلا سیمې ته محدود وي. د پیمانه بار، 100 nm.
بیا، موږ یوه فرضیه ازموینه وکړه چې په ER غشا کې موجود اوږد اسیل چین سیرامایډ (C26) د Gas1 ځانګړي کلسترینګ او ترتیب کول په انتخابي ERES کې پرمخ وړي. د دې هدف لپاره، موږ د خمیر تعدیل شوی فشار GhLag1 وکاراوه، په کوم کې چې دوه داخلي سیرامایډ ترکیبونه Lag1 او Lac1 د GhLag1 (د پنبې Lag1 هومولوګ) لخوا بدل شول، چې په پایله کې د خمیر فشار د حجرو غشا سره د سیرامایډ فشار د وحشي ډول څخه لنډ شو (شکل 3A) (28). د ډله ایز سپیکٹرومیټري (MS) تحلیل ښودلې چې په وحشي ډول ډول ډولونو کې، د ټول سیرامایډ 95٪ خورا اوږد (C26) چین سیرامایډ دی، پداسې حال کې چې په GhLag1 کې، د سیرامایډ 85٪ خورا اوږد (C18 او C16) دی. )، د سیرامایډ یوازې 2٪ ډیر اوږد (C26) چین سیرامایډ دی. که څه هم تر اوسه پورې په GhLag1 غشا کې C18 او C16 سیرامایډونه کشف شوي اصلي سیرامایډونه دي، د MS تحلیل دا هم تایید کړه چې د Gas1-GFP GPI لنگر چې په GhLag1 فشار کې څرګند شوی C26 سیرامایډ لري، کوم چې د وحشي ډول لیپیدونو سره پرتله کیدونکی دی. کیفیت ورته دی (انځور 3A) (26). له همدې امله، دا پدې مانا ده چې د سیرامایډ بیا رغولو انزایم Cwh43 د C26 سیرامایډ لپاره خورا انتخابي دی، لکه څنګه چې په شکل 26 کې ښودل شوی، دا په غوره توګه د GhLag1 فشار کې د C26 سیرامایډ لږ مقدار څخه د GPI لنگر شاملوي. S2 (29). سره له دې، د GhLag1 حجرو غشا اساسا یوازې C18-C16 سیرامایډ لري، پداسې حال کې چې Gas1-GFP لاهم C26 سیرامایډ لري. دا حقیقت دا فشار د ER کې د جھلی سیرامایډ د اکیل زنځیر اوږدوالي ستونزې په ځانګړي ډول حل کولو لپاره یو مثالی وسیله ګرځوي. د ټولګي او ترتیب کولو فرضي رول. بیا، موږ لومړی د C26 Gas1-GFP وړتیا مطالعه کړه چې د GhLag1 په کلسترونو کې د sec31-1 د تودوخې حساس میوټینټ ایلیل سره د دودیز فلوروسینس مایکروسکوپي له لارې راټول شي، چیرې چې یوازې اوږد (C18-C16) سلسله د ER غشا سیرامایډ کې شتون لري (انځور 3). موږ ولیدل چې په sec31-1 کې، د Gas1-GFP ډیری برخه په کلسترونو کې متمرکزه وه، پداسې حال کې چې Gas1-GFP په sec31-1 GhLag1 کې د اوږد (C18-C16) اوږد سیرامایډ ER غشا سره په عمده توګه کلستر شوی نه و او په ټول ER غشا کې ویشل شوی نه و. د دقیق کیدو لپاره، ځکه چې د C26 سیرامایډ پر بنسټ کلستر کول د ځانګړي ERES سره نږدې تړاو لري (شکل 1)، موږ بیا تحقیق وکړ چې ایا دا پروسه ممکن د ER صادراتو پروټین میکانیزم فعالیت هم پکې شامل وي. GPI-AP د ER صادراتو لپاره یو ځانګړی COPII سیسټم کاروي، کوم چې په فعاله توګه د GPI لنگر د ګلایکان برخې د Ted1 ساختماني بیا جوړونې لخوا تنظیم کیږي (30، 31). بیا د بیا ترکیب کونکی GPI-ګلایکان د ټرانس میمبرین کارګو ریسیپټر p24 کمپلیکس لخوا پیژندل کیږي، کوم چې په پایله کې په انتخابي ډول Lst1 استخداموي، کوم چې د لوی COPII کارګو بانډینګ فرعي واحد Sec24 یو ځانګړی isoform دی، د GPI-AP بډایه COPII جوړوي ویسیکلونه اړین دي (31-33). له همدې امله، موږ یو دوه ګونی میوټینټ جوړ کړ چې د دې واحد پروټینونو حذف کول (د p24 پیچلي برخې Emp24، GPI-ګلایکان ریموډلینګ انزایم Ted1 او ځانګړي COPII فرعي واحد Lst1) د sec31-1 میوټینټ سټرین سره یوځای کړل، او دوی یې مطالعه کړل ایا دا ممکنه ده چې د Gas1-کلستر GFP جوړ شي (شکل 3). موږ ولیدل چې په sec31-1emp24Δ او sec31-1ted1Δ کې، Gas1-GFP په عمده توګه غیر کلستر شوی او د ER جھلی په اوږدو کې ویشل شوی، لکه څنګه چې مخکې په sec31-1 GhLag1 کې لیدل شوی، پداسې حال کې چې په sec31-1lst1Δ کې، Gas1-GFP د sec31-1 په څیر. دا پایلې ښیي چې د ER غشا کې د C26 سیرامایډ شتون سربیره، د Gas1-GFP کلستر کول هم د p24 کمپلیکس سره تړلو ته اړتیا لري، او د Lst1 ځانګړي استخدام ته اړتیا نلري. بیا، موږ دا امکان وپلټلو چې په ER غشا کې د سیرامایډ زنځیر اوږدوالی کولی شي د Gas1-GFP تړل p24 ته تنظیم کړي. په هرصورت، موږ وموندله چې په غشا کې د C18-C16 سیرامایډ شتون د P24 کمپلیکس لخوا بیارغول شوي GPI-glycans (شکلونه S3 او S4، A او B) یا د GPI-AP سره تړل او د GPI-AP صادرولو وړتیا اغیزه نه کوي. د COPII فرعي ډول Lst1 استخدام کړئ (شکل S4C). له همدې امله، د C26 سیرامایډ پورې تړلي کلستر کول د ER صادرولو پروټین میکانیزمونو سره د پروټین تعاملاتو ته اړتیا نلري، مګر د لیپید اوږدوالي لخوا پرمخ وړل شوي بدیل ترتیب کولو میکانیزم ملاتړ کوي. بیا، موږ تحلیل وکړ چې ایا د ER غشا کې د سیرامایډ اسیل زنځیر اوږدوالی د Gas1-GFP د اغیزمن طبقه بندي لپاره د انتخابي ERES په توګه مهم دی. څرنګه چې د GhLag1 په سټرین کې Gas1 د لنډ زنځیر سیرامایډ سره د ER څخه وځي او پلازما غشا ته ننوځي (شکل S5)، موږ باور لرو چې که چیرې ترتیب د سیرامایډ اسیل زنځیر اوږدوالي لخوا پرمخ وړل کیږي، نو د GhLag1 سټرین کې Gas1 بیرته راګرځیدلی او تیریدلی شي. د ERES توکي د ورته جھلی سره.
(الف) د GhLag1 د حجرو غشا په عمده توګه لنډ C18-C16 سیرامایډونه لري، پداسې حال کې چې د Gas1-GFP د GPI لنگر لاهم د وحشي ډول حجرو په څیر ورته C26 IPC لري. پورته: د ډله ایز سپیکٹرومیټري (MS) لخوا د وحشي ډول (Wt) او GhLag1p سټرینونو په حجرو غشا کې د سیرامایډ د اکیل چین اوږدوالي تحلیل. معلومات د ټول سیرامایډ سلنه استازیتوب کوي. د دریو خپلواکو تجربو اوسط. د خطا بار = SD. دوه لکۍ بې جوړې t ازموینه. **** P ＜0.0001. ښکته پینل: د Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI لنگر کې د IPC د اکیل چین اوږدوالي MS تحلیل چې په وحشي ډول او GhLag1p سټرینونو کې څرګند شوی. معلومات د ټول IPC سیګنال سلنه استازیتوب کوي. د پنځو خپلواکو تجربو اوسط. د خطا بار = SD. دوه لکۍ بې جوړې t ازموینه. ns، مهم ندي. P = 0.9134. (ب) د sec31-1، sec31-1 GhLag1، sec31-1emp24Δ، sec31-1ted1Δ او sec31-1lst1Δ حجرو فلوروسینس مایکروګرافونه چې د ګالکټوز هڅول شوي Gas1-GFP څرګندوي د 30 دقیقو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ شوي او د 24 درجو سانتي ګراد وروسته د معمول فلوروسینس مایکروسکوپي ترسره کولو لپاره لیږدول شوي. سپین تیر: د ER Gas1-GFP کلستر. خلاص تیر: غیر کلستر شوی Gas1-GFP په ټول ER غشا کې ویشل شوی، د ER ځانګړتیا اټومي حلقوي داغ ښیې. د پیمانه بار، 5μm. (ج) د فوتو مایکروګراف اندازه کول چې په (ب) کې تشریح شوي. د punctate Gas1-GFP جوړښت سره د حجرو اوسط سلنه. په دریو خپلواکو تجربو کې، n≥300 حجرې. د غلطۍ بار = SD. دوه لکۍ بې جوړې t ازموینه. **** P ＜0.0001.
د دې ستونزې د مستقیم حل لپاره، موږ په GhLag1 کې د Sec31-1 د تودوخې حساس میوټینټ ایلیل (شکل 4 او فلم S4) سره د Gas1-GFP او Mid2-iRFP SCLIM لید ترسره کړ. وروسته له دې چې ER په 37 درجو سانتی ګراد کې وساتل شو او وروسته په 24 درجو سانتی ګراد کې خوشې شو، د نوي ترکیب شوي Gas1-GFP ډیری برخه کلستر نه شوه او د ER غشا په اوږدو کې توزیع نه شوه، لکه څنګه چې د دودیز مایکروسکوپونو لخوا لیدل کیږي (شکل 4، A او B). سربیره پردې، د ERES یوه لویه سلنه (67٪) په کې دوه ډوله کارګو شریک موقعیت لري (شکل 4D). د شکل 4C پینل 1 او 2 د ERES دوه ځانګړي مثالونه ښیې چې د Gas1-GFP او Mid2-GFP سره یوځای کیږي. سربیره پردې، دواړه توکي په ورته ERES کې استخدام شوي (شکل 4E، پینل 3 او فلم S4). له همدې امله، زموږ پایلې ښیي چې د ER غشا کې د سیرامایډ اسیل زنځیر اوږدوالی د ER پروټین راټولولو او طبقه بندي کولو یو مهم ټاکونکی دی.
د Sec31-1 GhLag1 حجرات چې د ګالکټوز هڅول شوي سرایتونه څرګندوي، Gas1-GFP (GPI-AP، شنه) او Mid2-iRFP (TMP، نیلي) او د ERES لیبل شوي Sec13-mCherry (ERES، میجنټا) په 37 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ کوي. د 30 دقیقو لپاره دوام ورکړئ، د سرایتونو خوشې کولو لپاره 24 درجو سانتي ګراد ته راکښته کړئ، او د 20 دقیقو وروسته د SCLIM سره عکس واخلئ. (A څخه C) د 2D پروجیکشن عکسونه (A؛ پیمانه بار، 1μm) یا د 3D حجرو نیمه کره انځورونه (B او C؛ پیمانه واحد، 0.45μm) د 10 z- برخو استازیتوب کوي چې د کارګو او ERES لخوا نښه شوي. په (B) کې ښکته پینل او په (C) کې پینل پروسس شوي عکسونه ښیې ترڅو یوازې په ERES (میجنټا) کې موجود توکي وښیې [Gas1-GFP (خړ) او Mid2-iRFP (روښانه نیلي)]. (C) سپین ډک تیر: ERES، توکي سره یوځای کیږي. خلاص تیر: ERES یوازې یو توکي لري. ښکته پینل: غوره شوي ERES د متقابل توکو (1 او 2) لري چې په (C) کې نښه شوي. د پیمانه بار، 100 nm. (D) د فوتو مایکروګراف اندازه کول چې په (C) کې تشریح شوي. په sec31-1 او sec31-1 GhLag1 واحدونو کې، یوازې یو کارګو (Gas1-GFP یا Mid2-iRFP) شامل دی، او د جلا شوي کارګو او متقابل کارګو لپاره د ERES اوسط سلنه. په دریو خپلواکو تجربو کې، n = 432 په 54 حجرو کې (sec31-1) او n = 430 په 47 حجرو کې (sec31-1 GhLag1). د غلطۍ بار = SD. دوه لکۍ بې جوړې t ازموینه. *** P = 0.0002 (sec31-1) او ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) د غوره شوي ERES 3D انځور چې د متقابل کارګو (3) سره په (C) کې نښه شوی. ګاز۱-جی ایف پي (شنه) او منځ۲-آی آر ایف پي (آبي) له ورته اړخ څخه ERES (میجنټا) ته نږدې کیږي او په ورته ERES محدوده سیمه کې پاتې کیږي. د پیمانه بار، ۱۰۰ نانومیټره.
دا څیړنه په مستقیم ډول شواهد وړاندې کوي چې د لیپید پر بنسټ پروټین کارګو د محرمې لارې کې په انتخابي صادراتي ځایونو کې طبقه بندي شوي، او د طبقه بندي انتخاب لپاره د اکیل چین اوږدوالي اهمیت څرګندوي. د SCLIM په نوم د یوې پیاوړې او عصري مایکروسکوپي تخنیک په کارولو سره، موږ په خمیر کې د نوي ترکیب شوي Gas1-GFP (د پلازما غشا GPI-AP یو لوی پلازما جھلی چې د ډیر اوږد اکیل چین (C26) سیرامایډ لیپید برخه لري) وښوده. هغه سیمې چې په جلا ERs کې کلستر شوي دي د ځانګړي ERES سره تړاو لري، پداسې حال کې چې د ټرانس میمبرین پټ شوي پروټینونه د ER جھلی په اوږدو کې ویشل شوي دي (شکل 1). سربیره پردې، دا دوه ډوله توکي په انتخابي ډول مختلف ERES ته ننوځي (شکل 2). په غشا کې د سیلولر سیرامایډ د اکیل چین اوږدوالی له C26 څخه C18-C16 ته راټیټ شوی، د ګاز1-GFP کلستر په جلا ER سیمه کې ګډوډ شوی، او ګاز1-GFP د ورته ERES له لارې د ټرانس میمبرین پروټین سره ER پریښودو لپاره بیا راګرځول کیږي (شکل 3 او شکل 3). 4).
که څه هم GPI-AP د ER څخه د وتلو لپاره د پروټین ځانګړي میکانیزم کاروي، موږ وموندله چې د C26 سیرامایډ پورې تړلی جلا کول د پروټین متفاوت تعاملاتو باندې تکیه نه کوي چې ممکن د ERES تخصص لامل شي (شکلونه S4 او S5). پرځای یې، زموږ موندنې د لیپید پر بنسټ پروټین کلستر کولو او وروسته د نورو کارګو خارجولو لخوا پرمخ وړل شوي بدیل طبقه بندي میکانیزم ملاتړ کوي. زموږ مشاهدې ښیي چې د Gas1-GFP سیمه یا کلستر چې د ځانګړي ERES سره تړاو لري د ټرانس میمبرین پټ شوي پروټین Mid2-iRFP نشتوالی لري، کوم چې دا په ګوته کوي چې د C26 سیرامایډ پورې تړلی GPI-AP کلستر به اړونده ERES ته د دوی ننوتل اسانه کړي، او په ورته وخت کې، ټرانس میمبرین خارج کړي. سرایتونه دې ځانګړي ERES ته ننوځي (شکلونه 1 او 2). برعکس، د ER جھلی کې د C18-C16 سیرامایډونو شتون د GPI-AP د سیمو یا کلسترونو جوړولو لامل نه کیږي، نو دوی د ټرانس میمبرین پټ شوي پروټینونه په ورته ERES کې نه خارجوي یا ځای نه نیسي (شکلونه 3 او 4). له همدې امله، موږ وړاندیز کوو چې C26 سیرامایډ د ځانګړو ERES سره تړلي پروټینونو کلستر کولو اسانتیا سره جلا کول او طبقه بندي پرمخ وړي.
د C26 سیرامایډ پورې تړلې کلسترینګ څنګه په یوه ځانګړي ER ساحه کې ترلاسه کړو؟ د غشا سیرامایډ د اړخ له پلوه جلا کیدو تمایل ممکن د GPI-AP او C26 سیرامایډ د ER غشا په ډیر غیر منظم لیپید چاپیریال کې کوچني او سمدلاسه ترتیب شوي لیپیدونه رامینځته کړي چې لنډ او غیر مشبوع ګلیسیرولیپیډونه لري. د کیفیت کلسترونه (17، 18). دا کوچني لنډمهاله کلسترونه د p24 کمپلیکس (34) سره تړلو وروسته په لویو، ډیر مستحکم کلسترونو کې نور هم یوځای کیدی شي. د دې سره په مطابقت کې، موږ وښودله چې C26 Gas1-GFP اړتیا لري چې د p24 کمپلیکس سره تعامل وکړي ترڅو لوی لیدل شوي کلسترونه جوړ کړي (شکل 3). د p24 کمپلیکس یو هیټروزایګس اولیګومر دی چې په خمیر کې د څلورو مختلف p24 ټرانس میمبرین پروټینونو څخه جوړ شوی دی (35)، کوم چې څو اړخیزه تړل چمتو کوي، کوم چې کولی شي د کوچني GPI-AP کلسترونو کراس لینک کولو لامل شي، په دې توګه لوی مستحکم کلستر (34) رامینځته کوي. د GPI-APs د پروټین ایکټوډومینونو ترمنځ تعامل ممکن د دوی په راټولیدو کې هم مرسته وکړي، لکه څنګه چې د تی لرونکو قطبي اپیتیلیل حجرو کې د دوی د ګولګي لیږد په جریان کې ښودل شوي (36). په هرصورت، کله چې C18-C16 سیرامایډ په ER غشا کې شتون ولري، کله چې p24 کمپلیکس د Gas1-GFP سره وصل شي، لوی جلا کلسترونه به نه جوړیږي. اصلي میکانیزم ممکن د اوږدې اسیل چین سیرامایډ ځانګړي فزیکي او کیمیاوي ملکیتونو پورې اړه ولري. د مصنوعي غشا بایو فزیک مطالعات ښیې چې که څه هم دواړه اوږد (C24) او لنډ (C18-C16) اسیل چین سیرامایډونه کولی شي د مرحلې جلا کیدو لامل شي، یوازې اوږد اسیل چین سیرامایډونه (C24) کولی شي د فلم بیا شکل ورکولو لپاره لوړ منحني او فلم موڑ ته وده ورکړي. د متقابل حوالې له لارې (17، 37، 38). دا ښودل شوي چې د TMED2 ټرانس میمبرین هیلیکس، د Emp24 انساني هومولوګ، په انتخابي ډول د C18 سیرامایډ پر بنسټ سپینګومیلین سره په سایټوپلازمیک لوبیولز کې تعامل کوي (39). د مالیکولر ډینامکس (MD) سمولیشنونو په کارولو سره، موږ وموندله چې دواړه C18 او C26 سیرامایډونه د Emp24 ټرانس میمبرین هیلیکس د سایټوپلازمیک لوبیولز شاوخوا راټولیږي، او دوی ورته غوره توبونه لري (شکل S6). دا د یادونې وړ ده چې دا په ګوته کوي چې د Emp24 ټرانس میمبرین هیلیکس کولی شي په غشا کې د لیپیدونو غیر متناسب ویش لامل شي. دا د تی لرونکو حجرو پراساس وروستۍ پایله ده. ورته MD سمولیشنونه د ایتر لیپیدونو شتون هم ښیې (40). له همدې امله، موږ اټکل کوو چې د ER26 په دوو لوبیولز کې C26 سیرامایډ په محلي ډول بډایه شوی دی. کله چې په لومینل لوبیولز کې GPI-AP په مستقیم ډول د څو اړخیزه p24 سره وصل شي او د c26 سیرامایډ د p24 شاوخوا په سایټوپلاسمیک لوبیولز کې راټول شي، دا کولی شي د ګوتو له لارې د پروټین راټولولو او د غشا منحني رامینځته کیدو ته وده ورکړي (41)، چې د GPI-AP لامل کیږي چې د ERES سره نږدې په جلا سیمو کې جلا شي، کوم چې د ER جھلی خورا منحني سیمې هم خوښوي (42). پخوانیو راپورونو د وړاندیز شوي میکانیزم ملاتړ وکړ (43، 44). د پلازما جھلی کې د سیرامایډ پر بنسټ ګلایکوسفینګولیپیډز (GSL) سره د اولیګولیکټینز، پیتوجنز یا انټي باډیز څو اړخیزه تړل د GSL لوی مجموعه رامینځته کوي، د مرحلې جلا کول زیاتوي او د غشا خرابوالي او داخلي کیدو لامل کیږي (44). ایوابوچي او داسې نور (۴۳) دا وموندل شوه چې د اوږد (C24) مګر لنډ نه (C16) اسیل زنځیرونو په شتون کې، د GSL لیکټوسیلسرامایډ سره تړلی څو اړخیز لیګنډ د لویو کلسترونو او غشا انویګینیشن رامینځته کولو لامل شو، او په پاڼو کې د سایټوپلازم لین-منځګړیتوب سیګنال لیږد د اسیل زنځیرونو لخوا په جوړه شوي نیوټروفیلونو کې انټرډیجیټ کیږي.
په تی لرونکو ژوو کې د قطبي شوي اپیتیلیل حجرو کې، د اپیکل پلازما غشا کچې ته د ګولګي ضد شبکې (TGN) غلظت د GPI-AP جلا کول او ترتیب کول کنټرولوي (10، 45). دا راټولول د GPI-AP اولیګومیریزیشن (36) لخوا پرمخ وړل کیږي، مګر دا ممکن د سیرامایډ زنځیر اوږدوالي پورې هم اړه ولري چې موږ یې په خمیر کې ګورو. که څه هم تی لرونکو ژوو GPI-AP د ایتر لیپید پر بنسټ لنگر لري، او د هغې کیمیاوي جوړښت د خورا اوږد اسیل چین سیرامایډ څخه خورا توپیر لري، یوې وروستۍ څیړنې موندلې چې دواړه لیپیدونه په ارتقايي ډول ورته فزیکي او کیمیاوي ملکیتونه او فعالیت لري (40). له همدې امله، د تی لرونکو ژوو په حجرو کې د ایتر لیپید برخه ممکن په خمیر کې د C26 سیرامایډ سره ورته وي، او د هغې رول د GPI-AP راټولولو او ترتیب کولو ته وده ورکولو لپاره په غشا کې د اوږدې زنځیر سیرامایډ سره ملګرتیا کول دي. که څه هم دا امکان لاهم په مستقیم ډول ازمول کیدو ته اړتیا لري، پخوانۍ موندنې ملاتړ کوي چې د ګولګي بدن ته د اوږدې اسیل چین سیرامایډ لیږد د سایټوپلاسمیک لیږد پروټینونو لخوا نه ترسره کیږي، مګر د خمیر په څیر د GPI لنگرونو ترکیب پورې اړه لري. له همدې امله، د تکامل محافظه کار میکانیزم داسې ښکاري چې په ورته ټرانسپورټ ویسیکل کې د خورا اوږد اسیل چین سیرامایډ او GPI-AP (13، 16، 20، 46، 47) په انتخابي ډول شریک لیږد وړتیا لري.
په خمیر او تی لرونکو حیواناتو قطبي اپیتیلیل حجرو سیسټمونو کې، د GPI-AP راټولول او د نورو پلازما غشا پروټینونو څخه جلا کول ټول د حجرو سطحې ته رسیدو دمخه پیښیږي. پالادینو او نورو (48) وموندله چې د تی لرونکو حیواناتو قطبي اپیتیلیل حجرو په TGN کې، د GPI-AP کلستر کول نه یوازې د اپیکل پلازما جھلی ته د GPI-APs د انتخابي طبقه بندي لپاره اړین دي، بلکه د GPI-APs د کلستر تنظیم او د هغې بیولوژیکي فعالیت هم تنظیموي. د حجرو سطحه. په خمیر کې، دې مطالعې ښودلې چې په ER کې د C26 سیرامایډ پورې تړلی GPI-AP کلستر کولی شي د پلازما جھلی کې د GPI-AP کلستر تنظیم او فعال فعالیت تنظیم کړي (24، 49). د دې ماډل سره سم، GhLag1 حجرې د GPI مخنیوی کونکو یا درملو سره حساسیت لري چې د حجرو دیوال بشپړتیا اغیزه کوي (28)، او د خمیر حجرو په ملګرتیا کې د ټیپ سیرامایډ د فعال ګاز 1-GFP کلسترونو (49) اړتیا د G​​​ د hLag1 حجرو احتمالي فزیولوژیکي پایلو ته اشاره کوي. د GPI-AP تېروتنه. په هرصورت، دا به زموږ د راتلونکي څیړنې موضوع وي چې ایا د حجرو د سطحې فعال تنظیم د ER څخه د لیپید اوږدوالي پراساس د ترتیب کولو میتود لخوا پروګرام شوی دی.
په دې کار کې کارول شوي Saccharomyces cerevisiae ډولونه په جدول S1 کې لیست شوي دي. د ژوندیو حجرو عکس العمل لپاره د SCLIM MMY1583 او MMY1635 ډولونه د W303 په شالید کې جوړ شوي. دا ډولونه چې د Sec13-mCherry څرګندوي د فلوروسینټ پروټین ټګ سره د پولیمریز چین عکس العمل (PCR) پر بنسټ میتود په کارولو سره د pFA6a پلازمیډ سره د ټیمپلیټ (23) په توګه جوړ شوي. هغه فشار چې Mid2-iRFP څرګندوي چې د GAL1 پروموټر کنټرول لاندې د فلوروسینټ پروټین سره لیبل شوی په لاندې ډول جوړ شوی. د pKTiRFP-KAN ویکتور څخه د iRFP-KanMx ترتیب PCR امپلیفیکیشن (د E. O'Shea ډالۍ، د اډجین پلازمیډ شمیره 64687؛ http://n2t.net/addgene: 64687؛ د څیړنې سرچینې پیژندونکی (RRID): Addgene_64687) او د endogenous Mid2 C-ټرمینس ته داخل شوی. وروسته له هغه چې د Mid2-iRFP جینوم ترتیب پراخ شو او د GAL1 پروموټر کې کلون شو، دا د ادغام پلازمید pRS306 د Not I-Sac I سایټ کې مدغم شو. پایله لرونکی پلازمید pRGS7 د Pst I سره خطي شو ترڅو د URA3 ځای سره مدغم شي.
د Gas1-GFP فیوژن جین د GAL1 پروموټر تر کنټرول لاندې په سینټرومیر (CEN) پلازمیډ کې څرګندیږي، کوم چې په لاندې ډول جوړ شوی دی. د Gas1-GFP ترتیب د PCR لخوا د pRS416-GAS1-GFP پلازمیډ (24) (د L. Popolo ډالۍ) څخه پراخه شوی او د CEN پلازمیډ pBEVY-GL LEU2 (د C ډالۍ) Xma I–Xho I سایټ ته کلون شوی. ملر؛ د اډجین پلازمیډ شمیره 51225؛ http://n2t.net/adddene: 51225؛ RRID: Adddene_51225). پایله لرونکی پلازمیډ pRGS6 نومول شوی. د Axl2-GFP فیوژن جین هم د pBEVY-GL LEU2 ویکتور د GAL1 پروموټر تر کنټرول لاندې څرګند شوی، او د هغې جوړښت په لاندې ډول دی. د Axl2-GFP ترتیب د PCR لخوا د pRS304-p2HSE-Axl2-GFP پلازمیډ (23) څخه لوړ شوی و، او د pBEVY-GL LEU2 ویکتور بام HI-Pst I سایټ ته کلون شوی و. پایله لرونکی پلازمیډ pRGS12 نومول شوی و. پدې څیړنه کې کارول شوي اولیګونیوکلیوټایډونو ترتیب په جدول S2 کې لیست شوی.
دا سټرین د 0.2٪ اډینین او 2٪ ګلوکوز [YP-dextrose (YPD)]، 2٪ رافینوز [YP-raffinose] بډایه خمیر استخراج پروټین p (YP) منځنی (1٪ خمیر استخراج او 2٪ پروټین ept) سره ضمیمه شوی و. (YPR)] یا 2٪ ګالکټوز [YP-galactose (YPG)] د کاربن سرچینې په توګه، یا په مصنوعي لږترلږه منځني (0.15٪ خمیر نایتروجن اساس او 0.5٪ امونیم سلفیټ) کې د تغذیې لپاره اړین مناسب امینو اسیدونه او اساسات بشپړولو لپاره، او د کاربن سرچینې په توګه 2٪ ګلوکوز (مصنوعي ګلوکوز لږترلږه منځنی) یا 2٪ ګالکټوز (مصنوعي ګلکټوز لږترلږه منځنی) لري.
د ریښتیني وخت عکس اخیستنې لپاره، د تودوخې حساس sec31-1 میوټینټ حجرې چې د GAL1 پروموټر لاندې جوړښت څرګندوي د YPR په منځنۍ تودوخه کې د شپې له خوا د 24 درجو سانتي ګراد څخه تر منځني لاګ مرحلې پورې وده شوې. د YPG کې د 1 ساعت لپاره په 24 درجو سانتي ګراد کې د شاملولو وروسته، حجرې د 30 دقیقو لپاره په SG کې په 37 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ شوې، او بیا د سرایت بلاک څخه د خوشې کیدو لپاره 24 درجو سانتي ګراد ته لیږدول شوې. کانکاناولین A د شیشې سلایډ کې د حجرو د سمولو لپاره کارول شوی و او د SCLIM لخوا انځور شوی و. SCLIM د Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope او UPlanSApo 100×1.4 عددي اپرچر تیلو لینز (Olympus)، د لوړ سرعت او لوړ سیګنال څخه تر شور تناسب څرخیدونکي ډیسک کنفوکال سکینر (Yokogawa Electric)، دودیز سپیکٹرومیټر، او دودیز کولنګ ترکیب دی. د سیسټم د عکس شدت ورکوونکی (Hamamatsu Photonics) کولی شي د میګنیفاینګ لینز سیسټم د ×266.7 وروستي میګنیفایشن او د چارج سره جوړه شوې وسیله کیمره چمتو کړي چې الکترونونه ضربوي (Hamamatsu Photonics) (21). د عکس ترلاسه کول د دودیز سافټویر (Yokogawa Electric) لخوا ترسره کیږي. د 3D عکسونو لپاره، موږ د عمودی لینز د حرکت کولو لپاره د دودیز جوړ شوي پیزو الیکټریک ایکچیویټر څخه کار واخیست، او نظري برخې یې په یوه سټیک کې 100 nm لرې راټولې کړې. د Z-stack عکس په 3D ووکسیل ډیټا بدل شوی، او د څرخیدونکي ډیسک کنفوکال مایکروسکوپ لپاره کارول شوی تیوریکي نقطه خپریدو فعالیت د Volocity سافټویر (PerkinElmer) لخوا د ډیکونوولوشن پروسس کولو لپاره کارول کیږي. د ګډ موقعیت تحلیل لپاره د اتوماتیک حد لپاره د Volocity سافټویر په کارولو سره، د کارګو په شمول ERES اندازه شو. د لاین سکین تحلیل د میټا مورف سافټویر (مالیکولر وسایل) په کارولو سره ترسره شو.
د احصایوي اهمیت د ټاکلو لپاره د ګراف پیډ پریزم سافټویر وکاروئ. د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي د ټیسټ او د تغیراتو عادي یو اړخیز تحلیل (ANOVA) ازموینې لپاره، د ډلو ترمنځ توپیرونه په P <0.05 (*) باندې د پام وړ اغیزه لري.
د Gas1-GFP د فلوروسینس مایکروسکوپي لپاره، د لاګ فیز حجرات په YPD کې د شپې لخوا کرل شوي او د سینټرفیوګیشن له لارې راټول شوي، د فاسفیټ بفر شوي مالګین سره دوه ځله مینځل شوي، او لږترلږه 15 دقیقو لپاره په یخ کې اچول شوي، او بیا د مایکروسکوپ لاندې پرمخ وړل شوي لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي چیک (24). د لییکا DMi8 مایکروسکوپ (HCX PL APO 1003/1.40 تیل PH3 CS) چې د مقصدي لینز، L5 (GFP) فلټر، هاماماتسو کیمره او د غوښتنلیک سویټ X (LAS X) سافټویر سره سمبال شوی و د استملاک لپاره کارول شوی و. .
نمونې د SDS نمونې بفر سره د 65 درجو سانتی ګراد په تودوخه کې د 10 دقیقو لپاره پاکې شوې، او بیا د SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) لخوا جلا شوې. د معافیت تحلیل لپاره، د نمونې 10 μl په هر لین کې بار شوي. لومړني انټي باډي: د خرگوش پولی کلونل انټي ګاز 1 د ​​1:3000 په کمولو کې، د خرگوش پولی کلونل انټي ایمپ 24 د 1:500 په کمولو کې، او د خرگوش پولی کلونل انټي GFP (د H. Riezman لخوا ډالۍ) د 1:3000 په کمولو کې وکاروئ. د موږک مونوکلونل انټي Pgk1 انټي باډي د 1:5000 په کمولو کې کارول شوې (د J. de la Cruz لخوا ډالۍ). دوهم انټي باډي: د هارسریډش پیرو آکسایډیز (HRP) د وزې د خرگوش ضد امیونوګلوبولین G (IgG) د 1:3000 (پیرس) په کمولو کې کارول کیږي. د HRP-conjugated وزو ضد موږک IgG د 1:3000 (Pierce) په کمولو کې کارول شوی و. د معافیت غبرګون زون د سوپر سیګنل ویسټ پیکو ریجنټ (ترمو فشر ساینټیفیک) د کیمیلومینیسینس میتود لخوا مشاهده شو.
لکه څنګه چې په (31) کې تشریح شوي، د طبیعي معافیت ضد تجربه په غني شوي ER کسر باندې ترسره شوه. په لنډه توګه، د خمیر حجرو د TNE بفر [50 mM tris-HCl (pH 7.5)، 150 mM NaCl، 5 mM EDTA، 1 mM فینیل میتیل سلفونیل فلورایډ او پروټیز مخنیوی کونکي مخلوط) سره په 600 nm (OD600) کې په 100 آپټیکل کثافت کې دوه ځله ومینځئ. دا د شیشې مڼو سره مات شو، او بیا د حجرو کثافات او د شیشې مڼې د سینټرفیوګیشن لخوا لرې شول. بیا سوپرنټینټ په 17,000 ګرامه کې د 15 دقیقو لپاره په 4°C کې سینټرفیوګ شو. ګولۍ په TNE کې بیا وځنډول شوه او ډیجیټلیس ساپونین د 1% وروستي غلظت ته اضافه شو. تعلیق د 1 ساعت لپاره د 4°C په څرخیدو سره انکیوبیټ شو، او بیا د نه حل کیدونکي اجزا د 13,000 ګرامه کې د 4°C په 60 دقیقو لپاره د سینټرفیوګیشن لخوا لرې شول. د Gas1-GFP د معافیت ضد درمل لپاره، لومړی نمونه د خالي اګاروز مڼو (ChromoTek) سره د 4 درجو سانتی ګراد په تودوخه کې د 1 ساعت لپاره پری انکیوبیټ کړئ، او بیا د GFP-Trap_A (ChromoTek) سره د 4 درجو سانتی ګراد په تودوخه کې د 3 ساعتونو لپاره انکیوبیټ کړئ. د معافیت ضد درمل شوي مڼې پنځه ځله د TNE سره ومینځل شوې چې 0.2٪ ډیګوکسیجنین لري، د SDS نمونې بفر سره ایلیټ شوي، په SDS-PAGE کې جلا شوي، او د معافیت ضد درملو لخوا تحلیل شوي.
لکه څنګه چې په (31) کې تشریح شوي، د کراس لینک کولو تعیین په غني شوي ER کسر باندې ترسره شو. په لنډه توګه، غني شوي ER کسر د 0.5 ملي میتر ډیتیوبیس (سوکسینیمایډیل پروپیونیټ) سره انکیوبیټ شو (پیرس، ترمو فشر ساینټیفیک، راکفورډ، IL، USA؛ 20°C، 20 دقیقې). د کراس لینک کولو تعامل د ګلایسین (50 ملي میتر وروستی غلظت، 5 دقیقې، 20°C) اضافه کولو سره قانع شو.
لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي (50)، د وحشي ډول او GhLag1 ډولونو کې د سیرامایډ MS تحلیل ترسره شو. په لنډه توګه، حجرات په YPD کې د 30 درجو سانتي ګراد په تودوخه کې د اکسپونینشل فیز (3 څخه تر 4 OD600 واحدونو / ملی لیتر) ته وده ورکړل شوه، او 25×107 حجرې راټولې شوې. د دوی میټابولیزم د ټرایکلورواسیټیک اسید سره مات شوی. د استخراج محلول [ایتانول، اوبه، ایتر، پیریډین او 4.2 N امونیم هایدروکسایډ (15:15:5:1:0.018 v/v)] او د داخلي معیاري C17 سیرامایډ (860517، اوانټي پولر لیپید) کیفیت 1.2 nmol وکاروئ. د استخراج د نرم الکلین هایدرولیسس ترسره کولو لپاره د مونومیتیلامین ریجنټ [میتانول، اوبه، n-بوتانول او میتیلامین محلول (4:3:1:5 v/v)] وکاروئ، او بیا د اوبو سره سنتر شوي n-بوتانول وکاروئ ترڅو مالګه پاکه کړئ. په پای کې، استخراج په مثبت حالت محلول [کلوروفارم/میتانول/اوبه (2:7:1) + 5 ملي میتر امونیم اسټیټ] کې بیا وځنډول شو او د ډله ایز سپیکٹرومیټر ته داخل شو. د سپینګولیپیډ مالیکولونو د پیژندنې او اندازه کولو لپاره د څو غبرګونونو څارنه (MRM) ترسره شوه. د TSQ وینټیج دریم کواډروپول ډله ایز سپیکٹرومیټر (ترمو فشر ساینسي) د لیپید تحلیل لپاره د روبوټیک نانو فلو ایون سرچینې نانومیټ HD (اډویون بایوسینسز، ایتاکا، نیویارک) سره سمبال دی. د ټکر انرژي د هر سیرامایډ کټګورۍ لپاره غوره شوې ده. د MS معلومات په مثبت حالت کې ترلاسه شوي. د هر بیولوژیکي نقل لپاره، د لیپید سیګنال د دریو خپلواکو اندازه کولو منځنی دی.
لکه څنګه چې په (31) کې تشریح شوي، هغه حجرې (800×107) چې Gas1-GFP څرګندوي د طبیعي معافیت سره مخ شوي. پاک شوی Gas1-GFP د SDS-PAGE لخوا جلا شو او د پولی وینیلایډین فلورایډ (PVDF) غشا ته لیږدول شو. پروټین د PVDF د امایډ تور سره د رنګ کولو سره لیدل کیده. د Gas1-GFP بانډ د PVDF څخه پرې شو او 5 ځله د میتانول سره او یو ځل د مایع کروماتګرافي-MS (LC-MS) درجې اوبو سره مینځل شو. د غشا پټه د 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0)، بفر او 500μl تازه منحل شوي 1 M سوډیم نایټریټ مخلوط سره د 3 ساعتونو لپاره د 3 ساعتونو لپاره د انکیوبیټ کولو سره، د لیپید برخه د Gas1-GFP څخه خوشې کیږي او د ګلوکوزامین او انوسیټول (51) ترمنځ د انوسین فاسفیټ سیرامایډ خوشې کول. له هغې وروسته، د غشا پټه د LC-MS درجې اوبو سره څلور ځله ومینځل شوه، د خونې په تودوخه کې وچه شوه، او د تحلیل پورې په -80 درجو سانتي ګراد کې د نایتروجن په فضا کې زیرمه شوه. د کنټرول په توګه، د هرې تجربې لپاره د PVDF غشا یوه خالي نمونه کارول شوې وه. د Gas1-GFP څخه استخراج شوي لیپید بیا د MS لخوا تحلیل شو لکه څنګه چې تشریح شوي (50). په لنډه توګه، د GPI-لیپید لرونکي PVDF پټې په 75μl منفي مولډ محلول [کلوروفارم/میتانول (1:2) + 5 mM امونیم اسټیټ] کې بیا وځنډول شوې او د الیکټرو سپری آیونیزیشن (ESI)-MRM/MS د سپینګولیپید ډولونو تحلیل (TSQ Vantage) تیر شو. پدې حالت کې، د MS معلومات په منفي آیون حالت کې ترلاسه شوي.
لکه څنګه چې مخکې یادونه وشوه، د GPI لنگر د لیپید برخه د [3H]-inositol-لیبل شوي GPI-AP (16) څخه جلا شوې وه. لیپیدونه د محلول سیسټم (55:45:10 کلوروفارم-میتانول-0.25٪ KCl) په کارولو سره د پتلي طبقې کروماتګرافي لخوا جلا شوي او د FLA-7000 (Fujifilm) په کارولو سره لیدل شوي.
هغه حجرې چې د Gas1-GFP (600×107) څرګندوي دوه ځله د TNE بفر سره د TNE بفر سره مینځل شوي، او د شیشې تسمو سره مات شوي، او بیا د حجرو د کثافاتو او شیشې تسمو لرې کولو لپاره سینټرفیوج شوي. بیا سوپرناټینټ په 17,000 ګرامه کې د 1 ساعت لپاره په 4 درجو سانتیګراد کې سینټرفیوج شوی. ګولۍ په TNE کې مینځل شوې او په TNE کې د 1 U PI-PLC (انویټروجن) سره چې 0.2٪ ډیجیټلیس ساپونین لري د 1 ساعت لپاره په 37 درجو سانتیګراد کې سینټرفیوج شوی. د انزایم درملنې وروسته، غشا د 17,000 ګرامه کې د 4 درجو سانتیګراد کې د 1 ساعت لپاره سینټرفیوجیشن لخوا لرې شوه. د Gas1-GFP د معافیت ورکولو لپاره، سوپرناټینټ د GFP-Trap_A (ChromoTek) سره د شپې په 4 درجو سانتیګراد کې سینټرفیوج شوی. د SDS-PAGE لخوا جلا شوی پاک شوی Gas1-GFP د Coomassie brilliant blue سره رنګ شوی و. د ګاز ۱-GFP د رنګ کولو بانډ د اوبو د جریان شاوخوا خړ رنګ څخه پرې شو، او بیا د آیوډواسیټامایډ سره د الکیلیشن او ډیتیوتریټول سره کمولو وروسته، د ټریپسین سره د جیل دننه هضم ترسره شو. د GPI-ګلایکان سره ټریپټیک پیپټایډونه او پیپټایډونه استخراج او وچ کړئ. وچ شوی پیپټایډ په ۲۰ μl اوبو کې منحل شو. یوه برخه (۸ μl) په LC کې داخل کړئ. د اوکټاډیسیلسیلین (ODS) کالم (Develosil 300ODS-HG-5؛ داخلي قطر ۱۵۰ ملي میتر × ۱.۰ ملي میتر؛ نومورا کیمیکل، ایچي پریفیکچر، جاپان) د ځانګړو تدریجي شرایطو لاندې پیپټایډونو جلا کولو لپاره کارول شوی و. ګرځنده مرحله محلول A (۰.۰۸٪ فارمیک اسید) او محلول B (۰.۱۵٪ فارمیک اسید په ۸۰٪ اسیتونټریل کې) دی. د اکسیلا HPLC سیسټم (ترمو فشر ساینسي، بوسټن، میساچوسټس) د محلول A سره د 55 دقیقو لپاره د 50 μl min-1 د جریان په کچه د 5 دقیقو لپاره د ستون د ایلوټ کولو لپاره کارول شوی و، او بیا د محلول B غلظت 40٪ ته لوړ شو. ، متحده ایالات). ایلوټ په دوامداره توګه د ESI آیون سرچینې ته معرفي شو، او ټریپټیک پیپټایډونه او پیپټایډونه د GPI-ګلایکان سره د LTQ اوربیټراپ XL (هایبرډ لینیر آیون ټریپ-اوربیټراپ ماس سپیکٹرومیټر؛ ترمو فشر ساینسي) لخوا تحلیل شول. په MS ترتیب کې، د کیپلیري سرچینې ولټاژ 4.5 kV ته ټاکل شوی و، او د لیږد کیپلیري تودوخه په 300 ° C کې ساتل شوې وه. د کیپلیري ولټاژ او د ټیوب لینز ولټاژ په ترتیب سره 15 V او 50 V ته ټاکل شوي وو. د MS معلومات د مثبت ایون حالت کې ترلاسه شوي (د 60,000 ریزولوشن؛ په هر ملیون کې د 10 برخو د ډله ایز دقت) د 300/m/z د وزن/چارج تناسب (m/z) 3000 په ډله ایز حد کې. د MS/MS معلومات د LTQ Orbitrap XL کې د آیون جال له لارې ترلاسه کیږي [لومړني 3 عددونه چې معلومات پرې تکیه کوي، د ټکر له امله جلا کول (CID)].
د MD سمولیشنونه د GROMACS (52) سافټویر او MARTINI 2 فورس فیلډ (53-55) په کارولو سره ترسره شول. بیا د CHARMM GUI میمبرین بلډر (56، 57) د ډایولیلفاسفاټیډیلچولین (DOPC) او Cer C18 یا DOPC او Cer C26 لرونکي بایلر جوړولو لپاره کارول شوی و. د Cer C26 ټوپولوژي او همغږي د سپنګوزین لکۍ څخه د اضافي مڼو لرې کولو سره د DXCE څخه اخیستل شوي. د دوه ګوني طبقې توازن کولو او چلولو لپاره لاندې تشریح شوي پروسې څخه کار واخلئ، بیا د سیسټم وروستي همغږي وکاروئ ترڅو د Emp24 لرونکی سیسټم جوړ کړئ. د خمیر Emp24 ټرانس میمبرین ډومین (د 173 څخه تر 193 پورې پاتې شوني) د بصري MD (VMD) وسیلې مالیکولر جوړښت (58) په کارولو سره د α-هیلیکس په توګه جوړ شو. بیا، د اوورلیپینګ لیپیډونو لرې کولو وروسته، پروټین په موټی ډول دانه شوی و او د CHARMM GUI په کارولو سره بایلر ته داخل شو. په وروستي سیسټم کې ۱۲۰۲ DOPC او ۳۰۲ Cer C26 یا ۱۱۹۷ DOPC او ۲۹۵ Cer C18 او Emp24 شامل دي. سیسټم د ۰.۱۵۰M غلظت ته ایونیز کړئ. د دوه دوه پوړیزو ترکیبونو لپاره څلور خپلواک نقلونه جوړ شوي.
د لیپید بای لایر د CHARMM GUI پروسې په کارولو سره متوازن کیږي، چې پکې د 405,000 ګامونو کمول او بیا توازن کول شامل دي، چیرې چې د موقعیت محدودیتونه په تدریجي ډول کم او له منځه وړل کیږي، او د وخت مرحله د 0.005 ps څخه 0.02 ps ته لوړه کیږي. د توازن وروسته، دا د 0.02 ps د وخت مرحله سره 6 µs تولیدوي. د Emp24 داخلولو وروسته، د سیسټم کمولو او متوازن کولو لپاره ورته CHARMM GUI پروسه وکاروئ، او بیا په تولید کې د 8 ثانیو لپاره پرمخ وړئ.
د ټولو سیسټمونو لپاره، د توازن پروسې په جریان کې، فشار د بیرینډسن باروسټاټ (59) لخوا کنټرول کیږي، او د تولید پروسې په جریان کې، فشار د پارینلو-رحمان باروسټاټ (60) لخوا کنټرول کیږي. په ټولو قضیو کې، اوسط فشار 1 بار دی او د نیمه ایزوټروپیک فشار جوړه کولو سکیم کارول کیږي. د توازن او تولید پروسې کې، د سرعت بیا کیلیبریشن سره ترموسټاټ (61) د پروټین، لیپید او محلول ذراتو د تودوخې د یوځای کولو لپاره په ترتیب سره کارول کیږي. د ټول عملیاتو په جریان کې، د هدف تودوخه 310K ده. د غیر تړلو تعامل د 0.005 بفر زغم سره د ویرلیټ سکیم په کارولو سره د جوړه کولو لیست رامینځته کولو سره محاسبه کیږي. د کولمب اصطلاح د عکس العمل ساحې او د 1.1 nm د کټ آف فاصلې په کارولو سره محاسبه کیږي. د وینډر والز اصطلاح د 1.1 nm د کټ آف فاصلې سره د کټ آف سکیم کاروي، او د ویرلیټ کټ آف سکیم د احتمالي ډرافټ لپاره کارول کیږي (62).
د VMD په کارولو سره، د DOPC فاسفیټ مڼو یا سیرامایډ AM1 مڼو او پروټین ترمنځ د قطع شوي طول موج 0.7 nm دی، او د هغو لیپیدونو شمیر چې د پروټین سره تعامل کوي محاسبه کیږي. د لاندې فورمول له مخې، د کمښت-غذایی (DE) فکتور محاسبه کړئ لکه څنګه چې په (63) کې دی: DE فکتور = (په پروټین 0.7 کې د ټولو لیپیدونو مقدار) په پروټین 0.7 کې (په ټول لیپیدونو کې د Cer مقدار)
راپور شوی ارزښت د اوسط په توګه ترلاسه کیږي، او د غلطیو بارونه د SE څلور خپلواکې کاپي دي. د DE فکتور احصایوي اهمیت د t ازموینې [(averageDE-factor-1)/SE] لخوا محاسبه کیږي. د یو لکۍ ویش څخه د P ارزښت محاسبه کړئ.
د GROMACS وسیله د هغه سیسټم د دوه بعدي اړخي کثافت نقشې محاسبه کولو لپاره کارول شوې وه چې د Emp24 لري د ټریس په وروستیو 250 ns کې. د سیرامایډ د غني کولو/کمولو نقشه ترلاسه کولو لپاره، د Cer کثافت نقشه د Cer او DOPC د نقشې د مجموعې سره ویشل کیږي، او بیا په بدن کې د Cer غلظت سره ویشل کیږي. د ورته رنګ نقشې پیمانه کارول کیږي.
د دې مقالې لپاره د اضافي موادو لپاره، مهرباني وکړئ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 وګورئ
دا یوه خلاصه لاسرسی لرونکې مقاله ده چې د کریټیو کامنز انتساب-غیر-تجارتي جواز شرایطو لاندې ویشل شوې ده، کوم چې په هر ډول رسنۍ کې د کارولو، ویشلو او تکثیر اجازه ورکوي، تر هغه چې وروستۍ کارول د سوداګریزې ګټې لپاره نه وي او اساس دا وي چې اصلي کار سم دی. حواله.
یادونه: موږ یوازې له تاسو څخه غوښتنه کوو چې خپل د برېښنالیک پته ورکړئ ترڅو هغه کس چې تاسو یې پاڼې ته وړاندیز کوئ پوه شي چې تاسو غواړئ چې دوی برېښنالیک وګوري او دا سپیم نه دی. موږ به هیڅ برېښنالیک پته ونه نیسو.
دا پوښتنه د دې لپاره کارول کیږي چې تاسو لیدونکي یاست او د اتوماتیک سپیم سپارلو مخه ونیسئ.
صوفیا رودریګوز-ګالارډو، کازو کوروکاوا، سوزانا سبیدو-بوزو، الیژاندرو کورټیز؛ ګومز (الجندرو کورټیس-ګومز)، اتسوکو اکیدا (اتسوکو اکیدا)، والیریا زونی (والریا زونی)، آکسیلیادورا اګیلیرا-رومیرو، اننا لوزیو سیروګی (لویروګی) لوپیز)، میهو واګا (میهو واګا)، میساکو ارمان (میساکو ارمان)، میاکو ریمان (میاکو ریمان)، پرو اکیرا، سټیفانو فاني، اکیهیکو ناکانو، مانویل مونیز
د درې بعدي لوړ ریزولوشن ریښتیني وخت امیجنگ په انتخابي محصول سایټونو کې د پروټین ترتیب کولو لپاره د سیرامایډ زنځیر اوږدوالي اهمیت څرګندوي.
صوفیا رودریګوز-ګالارډو، کازو کوروکاوا، سوزانا سبیدو-بوزو، الیژاندرو کورټیز؛ ګومز (الجندرو کورټیس-ګومز)، اتسوکو اکیدا (اتسوکو اکیدا)، والیریا زونی (والریا زونی)، آکسیلیادورا اګیلیرا-رومیرو، اننا لوزیو سیروګی (لویروګی) لوپیز)، میهو واګا (میهو واګا)، میساکو ارمان (میساکو ارمان)، میاکو ریمان (میاکو ریمان)، پرو اکیرا، سټیفانو فاني، اکیهیکو ناکانو، مانویل مونیز
د درې بعدي لوړ ریزولوشن ریښتیني وخت امیجنگ په انتخابي محصول سایټونو کې د پروټین ترتیب کولو لپاره د سیرامایډ زنځیر اوږدوالي اهمیت څرګندوي.
© 2020 د ساینس د پرمختګ لپاره امریکایی ټولنه. ټول حقونه خوندي دي. AAAS د HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef او COUNTER شریک دی. ساینس پرمختګ ISSN 2375-2548.