موږ مخکې راپور ورکړی و چې د کولمو څخه اخیستل شوي ټریپټوفان میټابولایټ انډول-3-پروپیونیک اسید (IPA) د سیرم کچه د ځيګر فایبروسس ناروغانو کې ټیټه ده. پدې څیړنه کې، موږ د سیرم IPA کچې په تړاو په چاغو ځيګرونو کې ټرانسکرپټوم او DNA میتیلوم څیړلی، او همدارنګه د ویټرو کې د هیپاټیک سټیلیټ حجرو (HSCs) د فینوټایپیک غیر فعالولو کې د IPA رول.
په دې څیړنه کې ۱۱۶ چاغ ناروغان شامل وو چې د دوهم ډول شکر ناروغۍ (T2DM) پرته وو (عمر یې ۴۶.۸ ± ۹.۳ کاله؛ BMI: ۴۲.۷ ± ۵.۰ کیلوګرامه/متر مربع) چې د کووپیو باریاټریک جراحي مرکز (KOBS) کې یې د باریاټریک جراحي ترسره کړه. د IPA د دوران کچه د مایع کروماتګرافي-ماس سپیکٹرومیټري (LC-MS) لخوا اندازه شوه، د ځیګر ټرانسکرپټوم تحلیل د ټول RNA ترتیب لخوا ترسره شو، او د DNA میتیلیشن تحلیل د انفینیم هیومن میتیلیشن ۴۵۰ بیډ چیپ په کارولو سره ترسره شو. د انسان د ځیګر سټیلیټ حجرې (LX-2) د ان ویټرو تجربو لپاره کارول شوې.
د سیرم IPA کچه د هغو جینونو د څرګندیدو سره تړاو لري چې په ځیګر کې د اپوپټوټیک، مایټوفاجیک، او اوږد عمر لارو کې ښکیل دي. د AKT سیرین/تریونین کایناز 1 (AKT1) جین د ځیګر په ټرانسکرپټ او DNA میتیلیشن پروفایلونو کې ترټولو زیات او غالب متقابل جین و. د IPA درملنې د اپوپټوسس لامل شو، د مایټوکونډریال تنفس کم شو، او د حجرو مورفولوژي او مایټوکونډریال متحرکات د جینونو څرګندونه تعدیل کولو سره بدل کړل چې د فایبروسس، اپوپټوسس، او د LX-2 حجرو بقا تنظیمولو لپاره پیژندل شوي.
په ګډه سره، دا معلومات ملاتړ کوي چې IPA احتمالي درملنې اغیزې لري او کولی شي اپوپټوسس رامینځته کړي او د HSC فینوټایپ غیر فعال حالت ته واړوي، په دې توګه د HSC فعالولو او مایټوکونډریال میټابولیزم سره د مداخلې له لارې د ځیګر فایبروسس مخنیوي امکان پراخوي.
د چاغوالي او میټابولیک سنډروم خپریدل د میټابولیک پلوه تړلي غوړ جگر ناروغۍ (MASLD) د ډیریدونکي پیښو سره تړاو لري؛ دا ناروغي د عمومي نفوس له 25٪ څخه تر 30٪ پورې اغیزه کوي [1]. د MASLD ایټیولوژي اصلي پایله د ځيګر فایبروسس دی، یو متحرک پروسه چې د فایبروس خارجي حجروي میټریکس (ECM) [2] دوامداره راټولیدو لخوا مشخص کیږي. په ځيګر فایبروسس کې ښکیل اصلي حجرې د هیپاټیک سټیلیټ حجرې (HSCs) دي، کوم چې څلور پیژندل شوي فینوټایپونه ښیې: خاموش، فعال، غیر فعال، او سینسنټ [3، 4]. HSCs فعال کیدی شي او د خاموش شکل څخه د لوړ انرژي غوښتنې سره د فایبروبلاست په څیر حجرو ته لیږدول کیدی شي، د α-smooth عضلاتو ایکټین (α-SMA) او ډول I کولیجن (Col-I) [5، 6] د زیاتوالي څرګندیدو سره. د ځيګر فایبروسس بیرته راګرځولو په جریان کې، فعال HSCs د اپوپټوسس یا غیر فعالیدو له لارې له مینځه وړل کیږي. په دې پروسو کې د فایبروجینک جینونو کمول او د پروسرویوال جینونو تعدیل (لکه NF-κB او PI3K/Akt سیګنالینګ لارې) [7، 8]، او همدارنګه د مایټوکونډریال متحرکاتو او فعالیت کې بدلونونه شامل دي [9].
د ټریپټوفان میټابولایټ انډول-3-پروپیونیک اسید (IPA) د سیرم کچه، چې په کولمو کې تولیدیږي، د انسان میټابولیک ناروغیو کې کمه شوې، پشمول د MASLD [10-13]. IPA د غذايي فایبر مصرف سره تړاو لري، د انټي اکسیډنټ او انفلاسیون ضد اغیزو لپاره پیژندل کیږي، او د رژیم لخوا هڅول شوي غیر الکولي سټیټو هیپاټایټس (NASH) فینوټایپ په ویوو او ان ویټرو کې کموي [11-14]. ځینې شواهد زموږ د پخوانۍ مطالعې څخه راځي، کوم چې ښودلې چې د کوپیو باریاټریک جراحي مطالعې (KOBS) کې د جگر فایبروسس پرته د چاغ ناروغانو په پرتله د سیرم IPA کچه ټیټه وه. سربیره پردې، موږ وښودله چې د IPA درملنه کولی شي د جینونو څرګندونه کمه کړي چې د حجرو چپکولو، حجرو مهاجرت او د هیماټوپوایټیک سټیم حجرو فعالولو کلاسیک نښه کونکي دي د انسان د هیپاټیک سټیلیټ حجرو (LX-2) ماډل کې او یو احتمالي هیپاټوپروټیک میټابولایټ دی [15]. په هرصورت، دا روښانه نده چې IPA څنګه د HSC اپوپټوسس او مایټوکونډریال بایو انرجیټکس فعالولو سره د جگر فایبروسس ریګریشن هڅوي.
دلته، موږ دا په ډاګه کوو چې د سیرم IPA د چاغوالي مګر غیر ډول 2 ډایبایټس (KOBS) اشخاصو په ځیګر کې د اپوپټوسس، مایټوفګي، او اوږد عمر لارو کې د غني شوي جینونو څرګندیدو سره تړاو لري. سربیره پردې، موږ وموندله چې IPA کولی شي د غیر فعالولو لارې له لارې د فعال هیماتوپویټیک سټیم حجرو (HSCs) پاکولو او تخریب لامل شي. دا پایلې د IPA لپاره یو نوی رول څرګندوي، دا د ځیګر فایبروسس ریګریشن هڅولو لپاره د احتمالي درملنې هدف جوړوي.
د KOBS په ډله کې یوه پخوانۍ څیړنه ښودلې چې د ځيګر فایبروسس ناروغانو د ځيګر فایبروسس پرته ناروغانو په پرتله د IPA کچه ټیټه وه [15]. د دوهم ډول شکر ناروغۍ احتمالي مغشوشونکي اغیزې له منځه وړلو لپاره، موږ د دوهم ډول شکر ناروغۍ پرته 116 چاغ ناروغان (اوسط عمر ± SD: 46.8 ± 9.3 کاله؛ BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (جدول 1) د KOBS روانې مطالعې څخه د مطالعې نفوس په توګه استخدام کړل [16]. ټولو ګډونوالو لیکلي خبرتیا رضایت ورکړ او د مطالعې پروتوکول د هیلسنکي د اعلامیې (54/2005، 104/2008 او 27/2010) سره سم د شمالي ساوو کاونټي روغتون د اخلاقو کمیټې لخوا تصویب شو.
د ځيګر بايوپسي نمونې د بارياټريک جراحي په جریان کې ترلاسه شوې او د تجربه لرونکو رنځپوهانو لخوا د مخکې تشریح شوي معیارونو سره سم د هسټولوژیکي پلوه ارزول شوي [17، 18]. د ارزونې معیارونه په ضمیمه جدول S1 کې لنډیز شوي او مخکې تشریح شوي [19].
د روژه نیولو سیرم نمونې د میټابولومیک تحلیل لپاره د غیر هدفمند مایع کروماتګرافي-ماس سپیکٹرومیټري (LC-MS) لخوا تحلیل شوې (n = 116). نمونې د UHPLC-qTOF-MS سیسټم (1290 LC، 6540 qTOF-MS، Agilent Technologies، Waldbronn، Karlsruhe، Germany) په کارولو سره تحلیل شوې لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي 19. د ایزوپروپیل الکول (IPA) پیژندنه د ساتلو وخت او د MS/MS سپیکٹرم د خالص معیارونو سره پرتله کولو پراساس وه. د IPA سیګنال شدت (د لوړوالي ساحه) په ټولو نورو تحلیلونو کې په پام کې نیول شوې وه [20].
د ټول ځیګر RNA ترتیب د Illumina HiSeq 2500 په کارولو سره ترسره شو او معلومات مخکې له مخکې پروسس شوي وو لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي [19, 21, 22]. موږ د MitoMiner 4.0 ډیټابیس څخه غوره شوي 1957 جینونو په کارولو سره د مایټوکونډریال فعالیت/بایوجینیسیس اغیزمن کولو ټرانسکرپټونو هدفمند توپیري څرګندونې تحلیل ترسره کړ [23]. د ځیګر DNA میتیلیشن تحلیل د انفینیم هیومن میتیلیشن 450 بیډ چیپ (ایلومینا، سان ډیاګو، CA، USA) په کارولو سره د ورته میتودولوژي په کارولو سره ترسره شو لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي [24, 25].
د انسان د ځیګر سټیلیټ حجرات (LX-2) د پروفیسور سټیفانو رومیو لخوا په مهربانۍ سره چمتو شوي وو او په DMEM/F12 میډیم (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) کې کرل شوي او ساتل شوي وو. د IPA د کاري دوز غوره کولو لپاره، LX-2 حجرات د IPA مختلف غلظت (10 μM, 100 μM او 1 mM; Sigma, 220027) سره د 24 ساعتونو لپاره په DMEM/F12 میډیم کې درملنه شوي. سربیره پردې، د HSCs غیر فعالولو لپاره د IPA وړتیا څیړلو لپاره، LX-2 حجرات د 5 ng/ml TGF-β1 (R&D سیسټمونه، 240-B-002/CF) او 1 mM IPA سره د 24 ساعتونو لپاره په سیرم فری میډیم کې ګډ درملنه شوي. د اړوندو وسایطو کنټرولونو لپاره، د TGF-β1 درملنې لپاره 4 nM HCL چې 0.1٪ BSA لري کارول شوی و او د IPA درملنې لپاره 0.05٪ DMSO کارول شوی و، او دواړه د ترکیب درملنې لپاره یوځای کارول شوي وو.
د اپوپټوسس ارزونه د FITC انیکسین V اپوپټوسس کشف کټ په کارولو سره د 7-AAD (بایولیجینډ، سان ډیاګو، CA، USA، Cat# 640922) سره د جوړونکي د لارښوونو سره سم ترسره شوه. په لنډه توګه، LX-2 (1 × 105 حجرې/څاه) د شپې په اوږدو کې په 12 څاه پلیټونو کې کرل شوي او بیا د IPA یا IPA او TGF-β1 څو دوزونو سره درملنه شوي. بله ورځ، لامبو وهونکي او تړلي حجرې راټولې شوې، ټریپسینائز شوې، د PBS سره مینځل شوې، د انیکسین V تړلي بفر کې بیا ځړول شوې، او د FITC-انیکسین V او 7-AAD سره د 15 دقیقو لپاره انکیوبیټ شوې.
په ژوندیو حجرو کې میتوکونډریا د اکسیډیټیو فعالیت لپاره د Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (ترمو فشر ساینسي، کارلسباد، CA) په کارولو سره رنګ شوي. د MTR ازموینو لپاره، LX-2 حجرې د IPA او TGF-β1 سره په مساوي کثافتونو کې انکیوبیټ شوي. د 24 ساعتونو وروسته، ژوندي حجرې ټریپسینائز شوي، د PBS سره مینځل شوي، او بیا د 100 μM MTR سره د سیرم فری میډیم کې د 37 °C په تودوخه کې د 20 دقیقو لپاره انکیوبیټ شوي لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي [26]. د ژوندیو حجرو مورفولوژي تحلیل لپاره، د حجرو اندازه او سایټوپلاسمیک پیچلتیا په ترتیب سره د فارورډ سکیټر (FSC) او سایډ سکیټر (SSC) پیرامیټرو په کارولو سره تحلیل شوې.
ټول معلومات (۳۰،۰۰۰ پیښې) د نووسایټ کوانټیون (اګیلینټ) په کارولو سره ترلاسه شوي او د نوو ایکسپریس® ۱.۴.۱ یا فلوجو V.۱۰ سافټویر په کارولو سره تحلیل شوي.
د اکسیجن مصرف کچه (OCR) او د حجرو څخه بهر تیزابیت کچه ​​(ECAR) په ریښتیني وخت کې د سی هارس ایکسټرا سیلولر فلکس تحلیل کونکي (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) په کارولو سره اندازه شوه چې د سی هارس XF سیل میټو سټریس سره سمبال وه د تولید کونکي لارښوونو سره سم. په لنډه توګه، 2 × 104 LX-2 حجرې/څاه د XF96 حجرو کلتور پلیټونو کې تخم شوي. د شپې د انکیوبیشن وروسته، حجرې د ایزوپروپانول (IPA) او TGF-β1 (ضمیمه میتودونه 1) سره درملنه شوې. د معلوماتو تحلیل د سی هارس XF ویو سافټویر په کارولو سره ترسره شو، چې پکې د سی هارس XF سیل انرژي فینوټایپ ټیسټ راپور جنریټر شامل دی. له دې څخه، د بایو انرجیټیک روغتیا شاخص (BHI) محاسبه شو [27].
ټول RNA په cDNA کې لیکل شوی و. د ځانګړو میتودونو لپاره، حواله وګورئ [15]. د انسان 60S ریبوسومل اسیدیک پروټین P0 (RPLP0) او سایکلوفیلین A1 (PPIA) mRNA کچه د جین کنټرولونو په توګه کارول شوې. د QuantStudio 6 pro Real-Time PCR سیسټم (ترمو فشر، لینډسمیر، هالنډ) د TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) یا Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline، BIO 94050) سره کارول شوی و، او د نسبي جین څرګندولو فولډ د پرتله کولو Ct ارزښت سایکلینګ پیرامیټرو (ΔΔCt) او ∆∆Ct میتود په کارولو سره محاسبه شوی و. د پرائمرونو توضیحات په ضمیمه جدولونو S2 او S3 کې چمتو شوي.
هستوي DNA (ncDNA) او مایټوکونډریال DNA (mtDNA) د DNeasy وینې او نسج کټ (Qiagen) په کارولو سره استخراج شوي لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي [28]. د mtDNA نسبي اندازه د هر هدف mtDNA سیمې د دریو هستوي DNA سیمو (mtDNA/ncDNA) جیومیټریک اوسط سره د تناسب محاسبه کولو سره محاسبه شوې، لکه څنګه چې په ضمیمه میتودونو 2 کې توضیح شوي. د mtDNA او ncDNA لپاره د پرائمرونو توضیحات په ضمیمه جدول S4 کې چمتو شوي.
ژوندۍ حجرې د Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (ترمو فشر ساینسي، کارلسباد، CA) سره رنګ شوي ترڅو د انټر سیلولر او انټراسیلولر مایټوکونډریال شبکې لیدل شي. LX-2 حجرې (1 × 104 حجرې/څاه) د شیشې په سلایډونو کې د اړوندو شیشې لاندې کلتور پلیټونو (Ibidi GmbH، Martinsried، جرمني) کې کرل شوي. د 24 ساعتونو وروسته، ژوندۍ LX-2 حجرې د 100 μM MTR سره د 20 دقیقو لپاره په 37 °C کې انکیوبیټ شوې او د حجرو نیوکلی د DAPI (1 μg/ml، Sigma-Aldrich) سره رنګ شوي لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي [29]. د Mitochondrial شبکې د Zeiss Axio Observer inverted مایکروسکوپ (Carl Zeiss Microimaging GmbH، Jena، جرمني) په کارولو سره لیدل شوي چې د Zeiss LSM 800 confocal ماډل سره په 37 °C کې د 5٪ CO2 سره د 63×NA 1.3 هدف په کارولو سره د 5٪ CO2 سره د رطوبت لرونکي فضا کې سمبال شوي. موږ د هر نمونې ډول لپاره لس د Z- لړۍ انځورونه ترلاسه کړل. هر Z- لړۍ 30 برخې لري، چې هر یو یې 9.86 μm ضخامت لري. د هرې نمونې لپاره، د لید د لسو مختلفو ساحو انځورونه د ZEN 2009 سافټویر (کارل زیس مایکرو امیجینګ GmbH، جینا، جرمني) په کارولو سره ترلاسه شوي، او د مایټوکونډریال مورفولوژي تحلیل د ImageJ سافټویر (v1.54d) [30، 31] په کارولو سره د ضمیمه میتودونو 3 کې توضیح شوي پیرامیټرونو سره سم ترسره شو.
حجرات د 0.1 M فاسفیټ بفر کې د 2٪ ګلوټارالډیهایډ سره تنظیم شوي، وروسته د 1٪ اوسمیم ټیټروکسایډ محلول (سیګما الډریچ، MO، USA) سره تنظیم شوي، په تدریجي ډول د اسیټون سره ډیهایډریټ شوي (مرک، ډارمسټادټ، جرمني)، او په پای کې په ایپوکسی رال کې ځای پرځای شوي. الټرا پتلي برخې چمتو شوي او د 1٪ یورانیل اسیټیټ (مرک، ډارمسټادټ، جرمني) او 1٪ لیډ سیټریټ (مرک، ډارمسټادټ، جرمني) سره رنګ شوي. الټراسټرکچرل عکسونه د JEM 2100F EXII لیږد الکترون مایکروسکوپ (JEOL Ltd، ټوکیو، جاپان) په کارولو سره د 80 kV په سرعت ولټاژ کې ترلاسه شوي.
د LX-2 حجرو مورفولوژي چې د IPA سره د 24 ساعتونو لپاره درملنه شوې وه د Zeiss inverted light مایکروسکوپ (Zeiss Axio Vert.A1 او AxioCam MRm، Jena، جرمني) په کارولو سره د 50x لویوالي په وخت کې د فیز-کنټراسټ مایکروسکوپي لخوا تحلیل شوه.
کلینیکي معلومات د اوسط ± معیاري انحراف یا میډین (انټرکوارټیل رینج: IQR) په توګه څرګند شوي. د تغیراتو یو اړخیز تحلیل (دوامداره متغیرات) یا χ² ازموینه (کټګوري متغیرات) د دریو مطالعاتو ډلو ترمنځ توپیرونو پرتله کولو لپاره کارول شوي. د غلط مثبت نرخ (FDR) د څو ازموینې لپاره د سمولو لپاره کارول شوی و، او د FDR < 0.05 سره جینونه د احصایوي پلوه مهم ګڼل شوي. د سپیرمین ارتباط تحلیل د IPA سیګنال شدت سره د CpG DNA میتیلیشن سره د ارتباط لپاره کارول شوی و، د نومول شوي p ارزښتونو (p < 0.05) سره راپور شوی.
د لارې تحلیل د ویب پر بنسټ د جین سیټ تحلیل وسیلې (WebGestalt) په کارولو سره د 268 ټرانسکرپټونو (نامعلومو p < 0.01)، 119 مایټوکونډریا سره تړلي ټرانسکرپټونو (نامعلومو p < 0.05)، او د 3093 ځیګر ټرانسکرپټونو څخه 4350 CpGs لپاره ترسره شو چې د گردش سیرم IPA کچې سره تړاو درلود. په آزاده توګه شتون لرونکی ویني DB (نسخه 2.1.0) وسیله د متقابل جینونو موندلو لپاره کارول شوې وه، او سټرینګ DB (نسخه 11.5) د پروټین-پروټین تعاملاتو لیدلو لپاره کارول شوې وه.
د LX-2 تجربې لپاره، نمونې د D'Agostino-Pearson ازموینې په کارولو سره د نورمالیت لپاره ازمول شوي. معلومات لږترلږه د دریو بیولوژیکي نقلونو څخه ترلاسه شوي او د بونفیروني پوسټ هاک ازموینې سره یو اړخیز ANOVA ته تابع شوي. د 0.05 څخه کم p- ارزښت په احصایوي ډول مهم ګڼل شوی. معلومات د اوسط ± SD په توګه وړاندې کیږي، او د تجربو شمیر په هر شکل کې ښودل شوی. ټول تحلیلونه او ګرافونه د وینډوز لپاره د ګراف پیډ پریزم 8 احصایوي سافټویر (ګراف پیډ سافټویر شرکت، نسخه 8.4.3، سان ډیاګو، امریکا) په کارولو سره ترسره شوي.
لومړی، موږ د سیرم IPA کچې د ځیګر، ټول بدن، او مایټوکونډریال ټرانسکرپټونو سره د تړاو څیړنه وکړه. د ټول ټرانسکرپټ پروفایل کې، د سیرم IPA کچې سره تړلی ترټولو پیاوړی جین MAPKAPK3 و (FDR = 0.0077؛ د مایټوجن فعال پروټین کایناز فعال پروټین کایناز 3)؛ د مایټوکونډریال پورې اړوند ټرانسکرپټ پروفایل کې، ترټولو پیاوړی تړلی جین AKT1 و (FDR = 0.7621؛ AKT سیرین/تریونین کایناز 1) (اضافي فایل 1 او اضافي فایل 2).
بیا موږ نړیوال ټرانسکرپټونه (n = 268؛ p < 0.01) او د مایټوکونډریا سره تړلي ټرانسکرپټونه (n = 119؛ p < 0.05) تحلیل کړل، په نهایت کې اپوپټوسس د خورا مهم کینونیکي لارې په توګه وپیژندل شو (p = 0.0089). د سیرم IPA کچو سره تړلي مایټوکونډریا ټرانسکرپټونو لپاره، موږ په اپوپټوسس (FDR = 0.00001)، مایټوفګي (FDR = 0.00029)، او TNF سیګنلینګ لارو (FDR = 0.000006) تمرکز وکړ (شکل 1A، جدول 2، او ضمیمه انځورونه 1A-B).
د سیرم IPA کچو سره په تړاو کې د نړیوال، مایټوکونډریا پورې اړوند ټرانسکرپټونو او د انسان په ځیګر کې د DNA میتیلیشن د اوورلیپ کولو تحلیل. A د 268 نړیوال ټرانسکرپټونو، 119 مایټوکونډریا پورې اړوند ټرانسکرپټونو، او DNA میتیلیټ شوي ټرانسکرپټونو استازیتوب کوي چې د سیرم IPA کچو سره تړلي 3092 CpG سایټونو سره نقشه شوي دي (د p ارزښتونه < 0.01 د نړیوال ټرانسکرپټونو او DNA میتیلیټ لپاره، او د p ارزښتونه < 0.05 د مایټوکونډریا پورې اړوند ټرانسکرپټونو لپاره). لوی اوورلیپینګ ټرانسکرپټونه په مینځ کې ښودل شوي (AKT1 او YKT6). B د 13 جینونو د تعامل نقشه چې د نورو جینونو سره د لوړ تعامل سکور (0.900) لري د 56 اوورلیپینګ جینونو (تور کرښې سیمه) څخه جوړه شوې وه چې د آنلاین وسیلې StringDB په کارولو سره د سیرم IPA کچو سره د پام وړ تړاو درلود. شنه: جینونه د جین اونټولوژي (GO) سیلولر برخې سره نقشه شوي: مایټوکونډریا (GO:0005739). AKT1 هغه پروټین دی چې د معلوماتو پر بنسټ (د متن کان کیندنې، تجربو، ډیټابیسونو، او ګډ بیان پر بنسټ) د نورو پروټینونو سره د تعامل لپاره ترټولو لوړه نمره (0.900) لري. د شبکې نوډونه پروټینونه استازیتوب کوي، او څنډې د پروټینونو ترمنځ اړیکې استازیتوب کوي.
څرنګه چې د کولمو مایکروبیوټا میټابولیتونه کولی شي د DNA میتیلیشن له لارې ایپی جینیټیک جوړښت تنظیم کړي [32]، موږ څیړنه وکړه چې ایا د سیرم IPA کچه د ځیګر DNA میتیلیشن سره تړاو لري. موږ وموندله چې د سیرم IPA کچې سره تړلي دوه لوی میتیلیشن سایټونه د پرولین-سیرین بډایه سیمه 3 (C19orf55) او د تودوخې شاک پروټین کورنۍ B (کوچنی) غړی 6 (HSPB6) ته نږدې وو (اضافي فایل 3). د 4350 CpG (p < 0.01) DNA میتیلیشن د سیرم IPA کچې سره تړاو درلود او د اوږد عمر تنظیمي لارو کې بډایه شو (p = 0.006) (شکل 1A، جدول 2، او ضمیمه شکل 1C).
د انسان په ځیګر کې د سیرم IPA کچې، نړیوال لیږدونو، مایټوکونډریا سره تړلي لیږدونو، او DNA میتیلیشن ترمنځ د اړیکو د بیولوژیکي میکانیزمونو د پوهیدو لپاره، موږ د تیرو لارو تحلیل کې پیژندل شوي جینونو یو اوورلیپ تحلیل ترسره کړ (شکل 1A). د 56 اوورلیپینګ جینونو (په شکل 1A کې د تورې کرښې دننه) د لارې بډایه کولو تحلیل پایلې وښودله چې د اپوپټوسس لاره (p = 0.00029) دوه جینونه روښانه کړل چې د دریو تحلیلونو لپاره عام دي: AKT1 او YKT6 (YKT6 v-SNARE هومولوګ)، لکه څنګه چې په وین ډیاګرام کې ښودل شوي (ضمیمه انځور 2 او انځور 1A). په زړه پورې خبره دا ده چې موږ وموندله چې AKT1 (cg19831386) او YKT6 (cg24161647) د سیرم IPA کچې سره په مثبت ډول تړاو درلود (اضافي فایل 3). د جین محصولاتو ترمنځ د احتمالي پروټین تعاملاتو پیژندلو لپاره، موږ د 56 اوورلیپینګ جینونو په مینځ کې د ان پټ په توګه د لوړ عام سیمې سکور (0.900) سره 13 جینونه غوره کړل او د تعامل نقشه یې جوړه کړه. د باور کچې (حاشوي باور) له مخې، د AKT1 جین چې لوړې نمرې (0.900) درلودې په سر کې و (شکل 1B).
د لارې تحلیل پر بنسټ، موږ وموندله چې اپوپټوسس لویه لاره وه، نو موږ څیړنه وکړه چې ایا د IPA درملنه به د HSCs په ویټرو کې اپوپټوسس اغیزه وکړي. موږ مخکې ښودلې وه چې د IPA مختلف خوراکونه (10 μM، 100 μM، او 1 mM) د LX-2 حجرو لپاره غیر زهرجن وو [15]. دې مطالعې ښودلې چې د IPA درملنه په 10 μM او 100 μM کې د عملي او نیکروټیک حجرو شمیر زیات کړ. په هرصورت، د کنټرول ګروپ سره پرتله کولو سره، د حجرو وړتیا د 1 mM IPA غلظت کې کمه شوه، پداسې حال کې چې د حجرو نیکروسیس کچه بدله پاتې شوه (شکل 2A، B). بیا، د LX-2 حجرو کې د اپوپټوسس هڅولو لپاره د غوره غلظت موندلو لپاره، موږ د 24 ساعتونو لپاره 10 μM، 100 μM، او 1 mM IPA ازموینه وکړه (شکل 2A-E او ضمیمه انځور 3A-B). په زړه پورې خبره دا ده چې IPA 10 μM او 100 μM د اپوپټوسس کچه (٪) کمه کړه، په هرصورت، IPA 1 mM د کنټرول په پرتله د ناوخته اپوپټوسس او اپوپټوسس کچه (٪) زیاته کړه او له همدې امله د نورو تجربو لپاره غوره شوه (شکلونه 2A-D).
IPA د LX-2 حجرو اپوپټوسس هڅوي. د انیکسین V او 7-AAD دوه ګونی داغ کولو طریقه د جریان سایټومیټري لخوا د اپوپټوټیک نرخ او د حجرو مورفولوژي اندازه کولو لپاره کارول شوې. د BA حجرې د 24 ساعتونو لپاره د 10 μM، 100 μM او 1 mM IPA سره یا د F–H TGF-β1 (5 ng/ml) او 1 mM IPA سره د 24 ساعتونو لپاره د سیرم څخه پاک میډیم کې انکیوبیټ شوي. A: ژوندي حجرې (Annexin V -/ 7AAD-)؛ B: نیکروټیک حجرې (Annexin V -/ 7AAD+)؛ C، F: لومړني (Annexin V +/ 7AAD-)؛ D، G: ناوخته (Annexin V+/7AAD.+)؛ E، H: د اپوپټوټیک نرخ (٪) کې د ټولو لومړني او ناوخته اپوپټوټیک حجرو سلنه. معلومات د اوسط ± SD، n = 3 خپلواکو تجربو په توګه څرګند شوي. احصایوي پرتله کول د بونفیروني پوسټ هاک ازموینې سره د یو اړخیز ANOVA په کارولو سره ترسره شوي. *p < 0.05؛ ****p < 0.0001
لکه څنګه چې موږ مخکې ښودلي، 5 ng/ml TGF-β1 کولی شي د کلاسیک مارکر جینونو د څرګندولو په زیاتولو سره د HSC فعالول رامینځته کړي [15]. د LX-2 حجرو درملنه د 5 ng/ml TGF-β1 او 1 mM IPA سره په ترکیب کې وشوه (انځور 2E–H). د TGF-β1 درملنې د اپوپټوسس کچه بدله نه کړه، په هرصورت، د IPA ګډ درملنې د TGF-β1 درملنې په پرتله د ناوخته اپوپټوسس او اپوپټوسس کچه (%) زیاته کړه (انځور 2E–H). دا پایلې ښیي چې 1 mM IPA کولی شي د TGF-β1 انډکشن څخه په خپلواکه توګه په LX-2 حجرو کې اپوپټوسس ته وده ورکړي.
موږ د LX-2 حجرو کې د مایټوکونډریال تنفس باندې د IPA اغیزې نوره هم وڅیړلې. پایلو وښودله چې 1 mM IPA د اکسیجن مصرف کچه (OCR) پیرامیټرونه کم کړل: د کنټرول ګروپ په پرتله غیر مایټوکونډریال تنفس، بیسل او اعظمي تنفس، پروټون لیک او ATP تولید (شکل 3A، B)، پداسې حال کې چې د بایو انرجیټیک روغتیا شاخص (BHI) بدلون نه دی راوستی.
IPA په LX-2 حجرو کې د مایټوکونډریال تنفس کموي. د مایټوکونډریال تنفس منحنی (OCR) د مایټوکونډریال تنفس پیرامیټرو په توګه وړاندې کیږي (غیر مایټوکونډریال تنفس، بیسال تنفس، اعظمي تنفس، پروټون لیک، ATP تولید، SRC او BHI). حجرې A او B په ترتیب سره د 24 ساعتونو لپاره د 10 μM، 100 μM او 1 mM IPA سره انکیوبیټ شوي. حجرې C او D په ترتیب سره د 24 ساعتونو لپاره د سیرم فری میډیم کې د TGF-β1 (5 ng/ml) او 1 mM IPA سره انکیوبیټ شوي. ټول اندازه کول د CyQuant کټ په کارولو سره د DNA مینځپانګې ته نورمال شوي. BHI: بایو انرجیټیک روغتیا شاخص؛ SRC: د تنفسي زیرمو ظرفیت؛ OCR: د اکسیجن مصرف کچه. معلومات د اوسط ± معیاري انحراف (SD)، n = 5 خپلواکو تجربو په توګه وړاندې کیږي. احصایوي پرتله کول د یو اړخیز ANOVA او بونفیروني پوسټ هاک ازموینې په کارولو سره ترسره شوي. *p < 0.05; **p < 0.01; او ***p < 0.001
د TGF-β1-فعال شوي LX-2 حجرو د بایو انرجیټیک پروفایل باندې د IPA اغیزې په اړه د لا جامع پوهاوي ترلاسه کولو لپاره، موږ د OCR لخوا د مایټوکونډریال اکسیډیټیو فاسفوریلیشن تحلیل کړ (انځور 3C، D). پایلو وښودله چې د TGF-β1 درملنه کولی شي د کنټرول ګروپ (انځور 3C، D) په پرتله اعظمي تنفس، تنفسي زیرمه ظرفیت (SRC) او BHI کم کړي. سربیره پردې، د ترکیب درملنې د بیسال تنفس، پروټون لیک او ATP تولید کم کړ، مګر SRC او BHI د TGF-β1 سره درملنه شوي په پرتله د پام وړ لوړ وو (انځور 3C، D).
موږ د سی هارس سافټویر لخوا چمتو شوی "حجروي انرژي فینوټایپ ازموینه" هم ترسره کړه (ضمیمه انځور 4A-D). لکه څنګه چې په ضمیمه انځور 3B کې ښودل شوي، د TGF-β1 درملنې وروسته د OCR او ECAR میټابولیک پوټینشیل دواړه کم شوي، په هرصورت، د کنټرول ګروپ په پرتله د ترکیب او IPA درملنې ګروپونو کې هیڅ توپیر نه دی لیدل شوی. سربیره پردې، د کنټرول ګروپ په پرتله د ترکیب او IPA درملنې وروسته د OCR د بیسال او فشار کچه دواړه کمه شوې (ضمیمه انځور 4C). په زړه پورې خبره دا ده چې د ترکیب درملنې سره ورته نمونه لیدل شوې، چیرې چې د TGF-β1 درملنې په پرتله د ECAR د بیسال او فشار کچې کې هیڅ بدلون نه دی لیدل شوی (ضمیمه انځور 4C). په HSCs کې، د مایټوکونډریال اکسیډیټیو فاسفوریلیشن کمښت او د TGF-β1 درملنې سره مخ کیدو وروسته د SCR او BHI بیرته راګرځولو لپاره د ترکیب درملنې وړتیا میټابولیک پوټینشیل (OCR او ECAR) بدل نه کړ. په ګډه سره، دا پایلې ښیي چې IPA ممکن په HSCs کې بایو انرجیټکس کم کړي، دا وړاندیز کوي چې IPA ممکن د ټیټ انرژي پروفایل رامینځته کړي چې د HSC فینوټایپ غیر فعالولو ته اړوي (ضمیمه شکل 4D).
د مایټوکونډریال ډینامیکس باندې د IPA اغیز د مایټوکونډریال مورفولوژي او شبکې اتصالاتو د درې اړخیزه اندازه کولو او همدارنګه د MTR سټینینګ (شکل 4 او ضمیمه شکل 5) په کارولو سره وڅیړل شو. شکل 4 ښیې چې د کنټرول ګروپ سره پرتله کولو سره، د TGF-β1 درملنې د سطحې منځنۍ ساحه، د څانګې شمیره، د څانګې ټول اوږدوالی، او د څانګې جنکشن شمیره (شکل 4A او B) کمه کړه او د مایټوکونډریا تناسب یې له کروی څخه منځمهاله مورفولوژي (شکل 4C) ته بدل کړ. یوازې د IPA درملنې د مایټوکونډریال اوسط حجم کم کړ او د کنټرول ګروپ (شکل 4A) په پرتله د مایټوکونډریا تناسب له کروی څخه منځمهاله مورفولوژي ته بدل کړ. برعکس، کروی، د څانګې اوسط اوږدوالی، او د مایټوکونډریال فعالیت چې د مایټوکونډریال غشا احتمالي پورې تړلي MTR (شکل 4A او E) لخوا ارزول شوی بدل نه شو او دا پیرامیټرونه د ډلو ترمنځ توپیر نه درلود. په ګډه اخیستل شوي، دا پایلې وړاندیز کوي چې د TGF-β1 او IPA درملنه د مایټوکونډریال شکل او اندازه او همدارنګه د شبکې پیچلتیا په ژوندیو LX-2 حجرو کې تعدیل کوي.
IPA په LX-2 حجرو کې د مایټوکونډریال متحرکات او د مایټوکونډریال DNA کثرت بدلوي. الف. د ژوندیو LX-2 حجرو استازي کنفوکل انځورونه چې د TGF-β1 (5 ng/ml) او 1 mM IPA سره د 24 ساعتونو لپاره د سیرم فری میډیم کې انکیوب شوي دي چې د مایټوکونډریال شبکې ښیې چې د Mitotracker™ Red CMXRos سره رنګ شوي او نیوکلی د DAPI سره نیلي رنګ شوي دي. ټولو معلوماتو کې په هر ګروپ کې لږترلږه 15 عکسونه شامل وو. موږ د هر نمونې ډول لپاره 10 Z-سټیک عکسونه ترلاسه کړل. د Z-axis هر ترتیب 30 ټوټې درلودې، هر یو یې د 9.86 μm ضخامت سره. د پیمانه بار: 10 μm. ب. استازي توکي (یوازې مایټوکونډریا) د عکس لپاره د تطبیقي حد پلي کولو سره پیژندل شوي. د مایټوکونډریال مورفولوژیکي شبکې اتصالاتو کمیتي تحلیل او پرتله کول د هر ګروپ ټولو حجرو لپاره ترسره شوي. ج. د مایټوکونډریال شکل تناسب فریکونسي. 0 ته نږدې ارزښتونه کروی شکلونه ښیې، او 1 ته نږدې ارزښتونه د فلیمینټس شکلونه ښیې. د مایټوکونډریال DNA (mtDNA) مینځپانګه د موادو او میتودونو کې تشریح شوي په توګه ټاکل شوې وه. د E Mitotracker™ Red CMXRos تحلیل د فلو سایټومیټري (30,000 پیښو) لخوا ترسره شو لکه څنګه چې په موادو او میتودونو کې تشریح شوي. معلومات د اوسط ± SD، n = 3 خپلواکو تجربو په توګه وړاندې کیږي. احصایوي پرتله کول د یو اړخیز ANOVA او بونفیروني پوسټ هاک ازموینې په کارولو سره ترسره شوي. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
بیا موږ د LX-2 حجرو کې د mtDNA مینځپانګه د مایټوکونډریال شمیرې شاخص په توګه تحلیل کړه. د کنټرول ګروپ سره پرتله کول، د TGF-β1-درملنې شوي ګروپ کې د mtDNA مینځپانګه زیاته شوه (شکل 4D). د TGF-β1-درملنې شوي ګروپ سره پرتله کول، د mtDNA مینځپانګه د ترکیب درملنې ګروپ کې کمه شوه (شکل 4D)، وړاندیز کوي چې IPA ممکن د mtDNA مینځپانګه او ممکن د مایټوکونډریال شمیره او همدارنګه د مایټوکونډریال تنفس (شکل 3C) کم کړي. سربیره پردې، داسې ښکاري چې IPA د ترکیب درملنې کې د mtDNA مینځپانګه کمه کړې مګر د MTR-منځګړیتوب مایټوکونډریال فعالیت اغیزه نه کوي (شکل 4A-C).
موږ د LX-2 حجرو کې د فایبروسیس، اپوپټوسس، بقا، او مایټوکونډریال ډینامیکس سره تړلي جینونو د mRNA کچې سره د IPA اړیکه وڅیړله (شکل 5A-D). د کنټرول ګروپ سره پرتله کولو سره، د TGF-β1 درملنې ګروپ د جینونو زیاتوالی څرګند کړ لکه د کولیجن ډول I α2 زنځیر (COL1A2)، α-هموار عضلاتو ایکټین (αSMA)، میټریکس میټالوپروټینیز 2 (MMP2)، د میټالوپروټینیز 1 نسج مخنیوی کونکی (TIMP1)، او ډینامین 1 په څیر جین (DRP1)، چې د فایبروسیس زیاتوالی او فعالیدل په ګوته کوي. سربیره پردې، د کنټرول ګروپ سره پرتله کولو سره، د TGF-β1 درملنې د اټومي امیندوارۍ X ریسیپټر (PXR)، کاسپیس 8 (CASP8)، MAPKAPK3، د B-حجرو α مخنیوی کونکی، د اټومي فاکتور κ جین رڼا پیپټایډ (NFκB1A) لوړونکی، او د اټومي فاکتور κB کیناز سبونیټ β (IKBKB) مخنیوی کونکی (شکل 5A-D) د mRNA کچه راټیټه کړه. د TGF-β1 درملنې په پرتله، د TGF-β1 او IPA سره ترکیب درملنه د COL1A2 او MMP2 څرګندونه کمه کړه، مګر د PXR، TIMP1، B-حجروي لیمفوما-2 (BCL-2)، CASP8، NFκB1A، NFκB1-β، او IKBKB د mRNA کچه یې لوړه کړه. د IPA درملنې د MMP2، Bcl-2 سره تړلي پروټین X (BAX)، AKT1، آپټیک ایټروفي پروټین 1 (OPA1)، او مایټوکونډریال فیوژن پروټین 2 (MFN2) څرګندونه د پام وړ کمه کړه، پداسې حال کې چې د CASP8، NFκB1A، NFκB1B، او IKBKB څرګندونه د کنټرول ګروپ په پرتله زیاته شوه. په هرصورت، د کاسپیس-3 (CASP3)، اپوپټوټیک پیپټیډیز فعالولو فاکتور 1 (APAF1)، مایټوکونډریال فیوژن پروټین 1 (MFN1)، او فیژن پروټین 1 (FIS1) په څرګندونه کې هیڅ توپیر ونه موندل شو. په ټولیز ډول، دا پایلې وړاندیز کوي چې د IPA درملنه د فایبروسیس، اپوپټوسس، بقا، او مایټوکونډریال متحرکاتو سره تړلي جینونو څرګندونه تعدیلوي. زموږ معلومات وړاندیز کوي چې د IPA درملنه په LX-2 حجرو کې فایبروسیس کموي؛ په ورته وخت کې، دا د فینوټایپ غیر فعالولو ته اړولو سره بقا هڅوي.
IPA په LX-2 حجرو کې د فایبروبلاست، اپوپټوټیک، ژوندی والي، او مایټوکونډریال ډینامیک جینونو څرګندونه تعدیلوي. هسټوګرامونه د انډوجینس کنټرول (RPLP0 یا PPIA) په پرتله د mRNA څرګندونه ښیې وروسته له دې چې LX-2 حجرې د TGF-β1 او IPA سره د 24 ساعتونو لپاره د سیرم څخه پاک میډیم کې هڅول شوي. A فایبروبلاستونه په ګوته کوي، B اپوپټوټیک حجرو ته اشاره کوي، C ژوندي پاتې شوي حجرې په ګوته کوي، او D د مایټوکونډریال ډینامیک جین څرګندونه په ګوته کوي. معلومات د اوسط ± معیاري انحراف (SD) په توګه وړاندې کیږي، n = 3 خپلواکې تجربې. احصایوي پرتله کول د یو اړخیز ANOVA او بونفیروني پوسټ هاک ازموینې په کارولو سره ترسره شوي. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
بیا، د حجرو په اندازه (FSC-H) او سایتوپلازمیک پیچلتیا (SSC-H) کې بدلونونه د جریان سایټومیټري (شکل 6A، B) لخوا ارزول شوي، او د IPA درملنې وروسته د حجرو مورفولوژي کې بدلونونه د لیږد الکترون مایکروسکوپي (TEM) او د فیز برعکس مایکروسکوپي (ضمنی شکل 6A-B) لخوا ارزول شوي. لکه څنګه چې تمه کیده، د TGF-β1 درملنې ګروپ کې حجرې د کنټرول ګروپ (شکل 6A، B) په پرتله په اندازې کې زیاتې شوې، چې د خام انډوپلازمیک ریټیکولم (ER*) او فاګولیسوسوم (P) کلاسیک پراختیا ښیې، چې د هیماتوپویټیک سټیم حجرو (HSC) فعالول په ګوته کوي (ضمنی شکل 6A). په هرصورت، د TGF-β1 درملنې ګروپ سره پرتله کول، د حجرو اندازه، سایتوپلازمیک پیچلتیا (شکل 6A، B)، او ER* مینځپانګه په TGF-β1 او IPA ترکیب درملنې ګروپ (ضمنی شکل 6A) کې کمه شوې. سربیره پردې، د IPA درملنې د کنټرول ګروپ په پرتله د حجرو اندازه، سایتوپلاسمیک پیچلتیا (انځورونه 6A، B)، P او ER* مینځپانګه (ضمیمه انځور 6A) کمه کړه. سربیره پردې، د کنټرول ګروپ په پرتله د IPA درملنې 24 ساعته وروسته د اپوپټوټیک حجرو مینځپانګه زیاته شوه (سپینې تیرونه، ضمیمه انځور 6B). په ټولیز ډول، دا پایلې وړاندیز کوي چې 1 mM IPA کولی شي HSC اپوپټوسس هڅوي او د TGF-β1 لخوا رامینځته شوي د حجرو مورفولوژیکي پیرامیټرو کې بدلونونه بیرته راولي، په دې توګه د حجرو اندازه او پیچلتیا تنظیموي، کوم چې ممکن د HSC غیر فعالیدو سره تړاو ولري.
IPA د LX-2 حجرو کې د حجرو اندازه او سایتوپلاسمیک پیچلتیا بدلوي. د جریان سایټومیټري تحلیل استازي انځورونه. تحلیل د LX-2 حجرو لپاره ځانګړی ګیټینګ ستراتیژي کارولې: د حجرو نفوس تعریف کولو لپاره SSC-A/FSC-A، د ډبلټونو پیژندلو لپاره FSC-H/FSC-A، او د حجرو اندازې او پیچلتیا تحلیل لپاره SSC-H/FSC-H. حجرې د 24 ساعتونو لپاره د سیرم فری میډیم کې د TGF-β1 (5 ng/ml) او 1 mM IPA سره انکیوبیټ شوي. LX-2 حجرې په ښکته کیڼ کواډرینټ (SSC-H-/FSC-H-)، پورتنۍ کیڼ کواډرینټ (SSC-H+/FSC-H-)، ښکته ښیې کواډرینټ (SSC-H-/FSC-H+)، او پورتنۍ ښیې کواډرینټ (SSC-H+/FSC-H+) کې د حجرو اندازې او سایتوپلاسمیک پیچلتیا تحلیل لپاره ویشل شوي. ب. د حجرو مورفولوژي د FSC-H (مخکې توزیع، د حجرو اندازه) او SSC-H (اړخیزه توزیع، د سایټوپلاسمیک پیچلتیا) (30,000 پیښې) په کارولو سره د جریان سایټومیټري لخوا تحلیل شوې. معلومات د اوسط ± SD، n = 3 خپلواکو تجربو په توګه وړاندې کیږي. احصایوي پرتله کول د یو اړخیز ANOVA او بونفیروني پوسټ هاک ازموینې په کارولو سره ترسره شوي. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 او ****p < 0.0001
د کولمو میټابولیتونه لکه IPA د څیړنې یوه ګرمه موضوع ګرځیدلې ده، چې وړاندیز کوي چې نوي هدفونه ممکن د کولمو مایکروبیوټا کې کشف شي. له همدې امله دا په زړه پورې ده چې IPA، یو میټابولیت چې موږ یې په انسانانو کې د ځیګر فایبروسس سره تړلی دی [15]، د څارویو په ماډلونو کې د احتمالي انټي فایبروټیک مرکب په توګه ښودل شوی [13، 14]. دلته، موږ د لومړي ځل لپاره د سیرم IPA او نړیوال ځیګر ټرانسکرپټومکس او DNA میتیلیشن ترمنځ اړیکه په چاغو اشخاصو کې پرته له ټایپ 2 ډایبایټس (T2D) څخه ښکاره کوو، چې اپوپټوسس، مایټوفګی او اوږد عمر روښانه کوي، او همدارنګه د احتمالي نوماند جین AKT1 چې د ځیګر هومیوستاسیس تنظیموي. زموږ د مطالعې بله نوښت دا دی چې موږ د LX-2 حجرو کې د اپوپټوسس، حجرو مورفولوژي، مایټوکونډریال بایو انرجیټکس او ډینامیک سره د IPA درملنې تعامل وښود، د ټیټ انرژي سپیکٹرم په ګوته کوي چې HSC فینوټایپ غیر فعالولو ته بدلوي، IPA د ځیګر فایبروسس ښه کولو لپاره احتمالي نوماند کوي.
موږ وموندله چې اپوپټوسس، مایټوفاګسي او اوږد عمر د ځيګر په جينونو کې غني شوي ترټولو مهم کانونیکي لارې وې چې د دوراني سیرم IPA سره تړاو لري. د مایټوکونډریال کیفیت کنټرول (MQC) سیسټم ګډوډي کولی شي د مایټوکونډریال اختلال، مایټوفاګسي او اپوپټوسس لامل شي، په دې توګه د MASLD پیښې ته وده ورکوي [33، 34]. له همدې امله، موږ اټکل کولی شو چې IPA ممکن د حجرو متحرکاتو او د مایټوکونډریال بشپړتیا ساتلو کې د اپوپټوسس، مایټوفاګسي او اوږد عمر له لارې په ځيګر کې دخیل وي. زموږ معلوماتو ښودلې چې دوه جینونه په دریو ازموینو کې عام وو: YKT6 او AKT1. دا د یادونې وړ ده چې YKT6 یو SNARE پروټین دی چې د حجرو غشا فیوژن پروسې کې دخیل دی. دا په آټوفاګوزوم کې د STX17 او SNAP29 سره د پیل کمپلیکس جوړولو سره په آټوفاګی او میټوفاګی کې رول لوبوي، په دې توګه د آټوفاګوزومونو او لایسوزومونو فیوژن ته وده ورکوي [35]. سربېره پردې، د YKT6 فعالیت له لاسه ورکول د مایټوفاګي د خرابوالي لامل کیږي [36]، پداسې حال کې چې د YKT6 لوړ تنظیم د هیپاټو سیلولر کارسنوما (HCC) د پرمختګ سره تړاو لري، چې د حجرو د بقا زیاتوالی ښیي [37]. له بلې خوا، AKT1 ترټولو مهم متقابل جین دی او د ځیګر په ناروغیو کې مهم رول لوبوي، پشمول د PI3K/AKT سیګنالینګ لاره، د حجرو دوره، د حجرو مهاجرت، تکثیر، فوکل چپکونکی، د مایټوکونډریال فعالیت، او د کولیجن سرایت [38-40]. فعال شوی PI3K/AKT سیګنالینګ لاره کولی شي د هیماتوپویټیک سټیم حجرو (HSCs) فعال کړي، کوم چې د خارجي حجرو میټریکس (ECM) تولید لپاره مسؤل حجرې دي، او د هغې بې نظمي ممکن د ځیګر فایبروسس پیښې او پرمختګ کې مرسته وکړي [40]. سربیره پردې، AKT د حجرو د بقا یو له مهمو فکتورونو څخه دی چې د p53 پورې تړلي حجرو اپوپټوسس مخنیوی کوي، او د AKT فعالول ممکن د ځیګر حجرو اپوپټوسس [41، 42] د مخنیوي سره تړاو ولري. ترلاسه شوي پایلې ښیي چې IPA ممکن د ځیګر مایټوکونډریا سره تړلي اپوپټوسس کې دخیل وي د هیپاټوسایټونو د اپوپټوسس ته د ننوتلو یا ژوندي پاتې کیدو ترمنځ پریکړې باندې تاثیر کولو سره. دا اغیزې ممکن د AKT او/یا YKT6 نوماند جینونو لخوا تنظیم شي، کوم چې د ځیګر هوموستاسیس لپاره خورا مهم دي.
زموږ پایلو وښودله چې د 1 mM IPA له امله د TGF-β1 درملنې څخه خپلواک LX-2 حجرو کې اپوپټوسس رامینځته شو او د مایټوکونډریال تنفس کم شو. دا د یادونې وړ ده چې اپوپټوسس د فایبروسس حل او هیماتوپویټیک سټیم سیل (HSC) فعالولو لپاره یوه لویه لاره ده، او د ځیګر فایبروسس د بیرته راګرځیدونکي فزیولوژیکي غبرګون کې هم یوه مهمه پیښه ده [4، 43]. سربیره پردې، د ترکیب درملنې وروسته د LX-2 حجرو کې د BHI بیا رغونه د مایټوکونډریال بایو انرجیټکس تنظیم کې د IPA احتمالي رول په اړه نوي بصیرتونه چمتو کړل. د آرام او غیر فعال شرایطو لاندې، هیماتوپویټیک حجرې معمولا د ATP تولید لپاره د مایټوکونډریال اکسیډیټیو فاسفوریلیشن کاروي او ټیټ میټابولیک فعالیت لري. له بلې خوا، د HSC فعالول د مایټوکونډریال تنفس او بایوسینتیسس ته وده ورکوي ترڅو د ګلایکولیټیک حالت ته د ننوتلو انرژي غوښتنو لپاره جبران وکړي [44]. دا حقیقت چې IPA میټابولیک پوټینشل او ECAR اغیزه نه ده کړې وړاندیز کوي چې ګلایکولیټیک لاره لږ لومړیتوب لري. په ورته ډول، یوې بلې څیړنې ښودلې چې 1 mM IPA د کارډیومایوسایټونو، د انسان هیپاټوسایټ حجرو لاین (Huh7) او د انسان د امبیلیکل رګ انډوتیلیل حجرو (HUVEC) کې د مایټوکونډریال تنفسي زنځیر فعالیت تعدیل کولو توان درلود؛ په هرصورت، د کارډیومایوسایټونو کې د ګلایکولیسس په اړه د IPA هیڅ اغیزه ونه موندل شوه، دا وړاندیز کوي چې IPA ممکن د نورو حجرو ډولونو بایو انرجیټکس اغیزه وکړي [45]. له همدې امله، موږ اټکل کوو چې 1 mM IPA ممکن د یو نرم کیمیاوي انکوپلر په توګه عمل وکړي، ځکه چې دا کولی شي د فایبروجینک جین څرګندونه، د حجرو مورفولوژي او مایټوکونډریال بایو انرجیټکس د پام وړ کم کړي پرته لدې چې د mtDNA مقدار بدل کړي [46]. د مایټوکونډریال انکوپلرونه کولی شي د کلتور لخوا هڅول شوي فایبروسس او HSC فعالول منع کړي [47] او د مایټوکونډریال ATP تولید کم کړي چې د ځینې پروټینونو لکه انکوپلینګ پروټینونو (UCP) یا اډینین نیوکلیوټایډ ټرانسلوکیس (ANT) لخوا تنظیم شوي یا هڅول شوي. د حجرو ډول پورې اړه لري، دا پدیده کولی شي حجرې د اپوپټوسس څخه خوندي کړي او/یا اپوپټوسس ته وده ورکړي [46]. په هرصورت، د هیماتوپویټیک سټیم حجرو غیر فعالولو کې د مایټوکونډریال غیر جوړونکي په توګه د IPA رول روښانه کولو لپاره نورو مطالعاتو ته اړتیا ده.
بیا موږ څیړنه وکړه چې ایا د مایټوکونډریال تنفس بدلونونه د ژوندیو LX-2 حجرو کې د مایټوکونډریال مورفولوژي کې منعکس کیږي. په زړه پورې خبره دا ده چې د TGF-β1 درملنه د مایټوکونډریال تناسب له کروی څخه منځمهاله ته بدلوي، د مایټوکونډریال شاخ کولو کمښت او د DRP1 د څرګندیدو زیاتوالي سره، چې د مایټوکونډریال فشن کې یو مهم فاکتور دی [48]. سربیره پردې، د مایټوکونډریال ټوټې کول د شبکې ټول پیچلتیا سره تړاو لري، او د فیوژن څخه فشن ته لیږد د هیماټوپوایټیک سټیم سیل (HSC) فعالولو لپاره خورا مهم دی، پداسې حال کې چې د مایټوکونډریال فشن مخنیوی د HSC اپوپټوسس لامل کیږي [49]. په دې توګه، زموږ پایلې ښیي چې د TGF-β1 درملنه ممکن د کم شوي شاخ کولو سره د مایټوکونډریال شبکې پیچلتیا کې کمښت رامینځته کړي، کوم چې د فعال هیماټوپوایټیک سټیم حجرو (HSCs) سره تړلي مایټوکونډریال فشن کې ډیر عام دی. سربیره پردې، زموږ معلوماتو ښودلې چې IPA کولی شي د مایټوکونډریال تناسب له کروی څخه منځمهاله شکل ته بدل کړي، په دې توګه د OPA1 او MFN2 څرګندونه کموي. مطالعاتو ښودلې چې د OPA1 ښکته کول کولی شي د مایټوکونډریال جھلی ظرفیت کې کمښت رامینځته کړي او د حجرو اپوپټوسس رامینځته کړي [50]. MFN2 د مایټوکونډریال فیوژن او اپوپټوسس منځګړیتوب لپاره پیژندل کیږي [51]. ترلاسه شوي پایلې وړاندیز کوي چې د TGF-β1 او/یا IPA لخوا د LX-2 حجرو شاملول د مایټوکونډریال شکل او اندازې، او همدارنګه د فعالولو حالت او د شبکې پیچلتیا تعدیل کوي.
زموږ پایلې ښیي چې د TGFβ-1 او IPA ترکیب درملنه کولی شي د اپوپټوسس څخه د تیښتې حجرو کې د فایبروسس، اپوپټوسس او بقا پورې اړوند جینونو د mRNA څرګندونه تنظیمولو سره د mtDNA او حجرو مورفولوژیکي پیرامیټرونه کم کړي. په حقیقت کې، IPA د AKT1 او مهم فایبروسس جینونو لکه COL1A2 او MMP2 د mRNA څرګندونه کچه کمه کړه، مګر د CASP8 د څرګندولو کچه یې لوړه کړه، کوم چې د اپوپټوسس سره تړاو لري. زموږ پایلې ښودلې چې د IPA درملنې وروسته، د BAX څرګندونه کمه شوه او د TIMP1 کورنۍ فرعي واحدونو، BCL-2 او NF-κB د mRNA څرګندونه زیاته شوه، دا وړاندیز کوي چې IPA کولی شي د هیماتوپویټیک سټیم حجرو (HSCs) کې د بقا سیګنالونه هڅوي چې اپوپټوسس څخه تیښته کوي. دا مالیکولونه ممکن په فعال شوي هیماتوپویټیک سټیم حجرو کې د بقا پرو سرویوال سیګنالونو په توګه عمل وکړي، کوم چې ممکن د انټي اپوپټوټیک پروټینونو (لکه Bcl-2) د زیاتوالي سره تړاو ولري، د پرو اپوپټوټیک BAX څرګندونه کمه شوې، او د TIMP او NF-κB ترمنځ پیچلې تعامل [5، 7]. IPA د PXR له لارې خپل اغیزې کاروي، او موږ وموندله چې د TGF-β1 او IPA سره ترکیب درملنه د PXR mRNA د څرګندولو کچه لوړه کړې، چې د HSC فعالولو فشار په ګوته کوي. فعال PXR سیګنالینګ په ویوو او ان ویټرو دواړو کې د HSC فعالولو مخنیوي لپاره پیژندل کیږي [52، 53]. زموږ پایلې ښیې چې IPA ممکن د اپوپټوسس هڅولو، فایبروسس او مایټوکونډریال میټابولیزم کمولو، او د بقا سیګنالونو لوړولو سره د فعال HSCs پاکولو کې برخه واخلي، کوم چې عادي پروسې دي چې فعال HSC فینوټایپ په غیر فعال شوي ته بدلوي. په اپوپټوسس کې د IPA احتمالي میکانیزم او رول لپاره بل احتمالي توضیح دا دی چې دا په عمده توګه د مایټوفاګي (داخلي لاره) او بهرنۍ TNF سیګنالینګ لارې (جدول 1) له لارې غیر فعال مایټوکونډریا پاکوي، کوم چې مستقیم د NF-κB د بقا سیګنالینګ لارې سره تړاو لري (ضمیمه شکل 7). په زړه پورې خبره دا ده چې د IPA پورې اړوند غني شوي جینونه د اپوپټوټیک لارې [54] کې د پرو اپوپټوټیک او پرو بقا سیګنالونو هڅولو توان لري، دا وړاندیز کوي چې IPA ممکن د دې جینونو سره د تعامل له لارې د اپوپټوټیک لاره یا بقا هڅوي. په هرصورت، څنګه IPA د HSC فعالولو پرمهال اپوپټوسیس یا بقا هڅوي او د هغې میخانیکي لارې روښانه نه دي.
IPA یو مایکروبیل میټابولایټ دی چې د کولمو مایکروبیوټا له لارې د غذایی ټریپټوفان څخه جوړ شوی. مطالعاتو ښودلې چې دا د کولمو په چاپیریال کې د التهاب ضد، انټي اکسیډنټ، او ایپی جینیټیک تنظیمي ځانګړتیاوې لري. [55] مطالعاتو ښودلې چې IPA کولی شي د کولمو خنډ فعالیت تعدیل کړي او اکسیډیټیو فشار کم کړي، کوم چې ممکن د هغې سیمه ایز فیزولوژیکي اغیزو کې مرسته وکړي. [56] په حقیقت کې، IPA د دوران له لارې هدف ارګانونو ته لیږدول کیږي، او څرنګه چې IPA د ټریپټوفان، سیروټونین، او انډول مشتقاتو سره ورته لوی میټابولیټ جوړښت شریکوي، IPA میټابولیک عملونه ترسره کوي چې پایله یې د سیالۍ وړ میټابولیک برخلیک دی. [52] IPA ممکن د انزایمونو یا ریسیپټرونو د تړلو سایټونو لپاره د ټریپټوفان څخه اخیستل شوي میټابولیتونو سره سیالي وکړي، په بالقوه توګه د نورمال میټابولیک لارو ګډوډولو لپاره. دا د دې د فارماکوکینیټکس او فارماکوډینامیکونو په اړه د نورو مطالعاتو اړتیا روښانه کوي ترڅو د دې درملنې کړکۍ ښه پوه شي. [57] دا لیدل کیږي چې ایا دا په هیماتوپویټیک سټیم حجرو (HSCs) کې هم پیښ کیدی شي.
موږ دا منو چې زموږ څیړنه ځینې محدودیتونه لري. د IPA سره په ځانګړې توګه د اړیکو معاینه کولو لپاره، موږ د ټایپ 2 ډایبایټس میلیتس (T2DM) ناروغان خارج کړل. موږ دا منو چې دا زموږ د موندنو پراخه تطبیق د ټایپ 2 ډایبایټس میلیتس او پرمختللي ځیګر ناروغۍ ناروغانو لپاره محدودوي. که څه هم په انسان سیرم کې د IPA فزیولوژیکي غلظت 1-10 μM دی [11، 20]، د 1 mM IPA غلظت د لوړ غیر زهرجن غلظت [15] او د اپوپټوسس ترټولو لوړ نرخ پراساس غوره شوی، د نیکروټیک حجرو نفوس سلنه کې هیڅ توپیر نلري. که څه هم پدې څیړنه کې د IPA سوپرافیزیولوژیکي کچې کارول شوي، اوس مهال د IPA د مؤثره خوراک په اړه هیڅ اجماع شتون نلري [52]. که څه هم زموږ پایلې د پام وړ دي، د IPA پراخه میټابولیک برخلیک د څیړنې فعاله ساحه پاتې ده. سربیره پردې، د سیرم IPA کچې او د ځیګر ټرانسکرپټونو DNA میتیلیشن ترمنځ د اړیکې په اړه زموږ موندنې نه یوازې د هیماتوپویټیک سټیم حجرو (HSCs) څخه ترلاسه شوي بلکه د ځیګر نسجونو څخه هم ترلاسه شوي. موږ د ټرانسکرپټوم تحلیل څخه زموږ د پخوانیو موندنو پراساس د انسان LX-2 حجرو کارول غوره کړل چې IPA د هیماتوپویټیک سټیم سیل (HSC) فعالولو سره تړاو لري [15]، او HSCs د ځیګر فایبروسس پرمختګ کې دخیل لوی حجرې دي. ځیګر د څو حجرو ډولونو څخه جوړ شوی دی، نو د حجرو نور ماډلونه لکه د هیپاټوسایټ-HSC- معافیت حجرو ګډ کلتور سیسټم د کاسپیس فعالولو او DNA ټوټې کولو سره یوځای شوی او همدارنګه د عمل میکانیزم په شمول د پروټین کچه باید د IPA رول او د نورو ځیګر حجرو ډولونو سره د هغې تعامل مطالعه کولو لپاره په پام کې ونیول شي.