د Nature.com د لیدلو لپاره مننه. د هغه براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري. د غوره پایلو لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو د خپل براوزر نوې نسخه وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ). په عین حال کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ د سټایل کولو یا جاواسکریپټ پرته ښیې.
پروپیونیک اسید (PPA) د عصبي پراختیایي اختلالاتو لکه د آټیزم سپیکٹرم اختلال کې د مایټوکونډریال اختلال رول مطالعه کولو لپاره کارول کیږي. PPA د مایټوکونډریال بایوجینیسیس، میټابولیزم، او بدلون ګډوډولو لپاره پیژندل کیږي. په هرصورت، د دې میکانیزمونو پیچلي وختي طبیعت له امله د مایټوکونډریال متحرکاتو، فشن او فیوژن باندې د PPA اغیزې ستونزې پاتې دي. دلته، موږ د بشپړونکي کمیتي امیجنگ تخنیکونو څخه کار اخلو ترڅو وڅیړو چې PPA څنګه د نیورون په څیر SH-SY5Y حجرو کې د مایټوکونډریال الټراسټرکچر، مورفولوژي، او ډینامیک اغیزه کوي. PPA (5 mM) د مایټوکونډریال ساحه (p < 0.01)، د فیرټ قطر او محیط (p < 0.05)، او ساحه 2 (p < 0.01) کې د پام وړ کمښت رامینځته کړی. د مایټوکونډریال پیښې لوکیټر تحلیل د فشن او فیوژن پیښو کې د پام وړ زیاتوالی (p < 0.05) ښودلی، په دې توګه د فشار شرایطو لاندې د مایټوکونډریال شبکې بشپړتیا ساتل کیږي. برسېره پردې، د cMYC (p < 0.0001)، NRF1 (p < 0.01)، TFAM (p < 0.05)، STOML2 (p < 0.0001) او OPA1 (p < 0.05) د mRNA څرګندونه د پام وړ کمه شوې وه. 01). دا د فشار شرایطو لاندې د فعالیت ساتلو لپاره د مایټوکونډریال مورفولوژي، بایوجینیسیس او ډینامیکونو بیا رغونه ښیې. زموږ معلومات د مایټوکونډریال ډینامیکونو باندې د PPA اغیزو په اړه نوې بصیرت چمتو کوي او د مایټوکونډریال فشار غبرګونونو کې د ښکیلو پیچلو تنظیمي میکانیزمونو مطالعې لپاره د عکس اخیستنې تخنیکونو ګټورتیا روښانه کوي.
مایټوکونډریا د انرژۍ تولید او بایوسینتیزس کې د دوی د عادي رولونو هاخوا په مختلفو حجروي دندو کې لازمي برخه اخیستونکي دي. مایټوکونډریا میټابولیزم د کلسیم سیګنالینګ، میټابولیک او ریډوکس هوموستاسیس، التهابي سیګنالینګ، ایپی جینیټیک تعدیلاتو، د حجرو تکثیر، توپیر او پروګرام شوي حجرو مړینې یو مهم تنظیم کونکی دی. په ځانګړې توګه، مایټوکونډریا میټابولیزم د نیورونال پراختیا، بقا او فعالیت لپاره خورا مهم دی او په پراخه کچه د نیوروپیتولوژي 2,3,4 مختلفو څرګندونو کې ښکیل دی.
په تیرو لسیزو کې، میټابولیک حالت د نیوروجینیسیس، توپیر، پختګۍ او پلاستیکیت د مرکزي تنظیم کونکي په توګه راڅرګند شوی دی5,6. په دې وروستیو کې، د مایټوکونډریال مورفولوژي او متحرکات د مایټوسس په ځانګړي ډول مهم اجزا ګرځیدلي دي، یو متحرک پروسه چې د حجرو دننه د صحي مایټوکونډریا حوض ساتي. د مایټوکونډریال متحرکات د پیچلو متقابلو لارو لخوا تنظیم کیږي چې د مایټوکونډریال بایوجینیسیس او بایو انرجیټکس څخه د مایټوکونډریال فشن، فیوژن، ټرانسپورټ او پاکولو پورې دي7,8. د دې هر یو ادغام میکانیزم ګډوډي د صحي مایټوکونډریال شبکو ساتنه زیانمنوي او د عصبي پراختیا لپاره ژورې فعالې پایلې لري9,10. په حقیقت کې، د مایټوکونډریال متحرکاتو بې نظمي په ډیری رواني، عصبي او عصبي پراختیایی اختلالاتو کې لیدل کیږي، پشمول د آټیزم سپیکٹرم اختلالات (ASD)11,12.
ASD یو متفاوت عصبي پراختیایی اختلال دی چې پیچلي جینیاتي او ایپی جینیټیک جوړښت لري. د ASD میراثیت بې له شکه دی، مګر د مالیکولر ایټیولوژي اصلي لامل یې په کمزوري ډول نه پوهیږي. د پری کلینیکي ماډلونو، کلینیکي مطالعاتو، او څو اومیک مالیکولر ډیټاسیټونو څخه د معلوماتو راټولول په ASD13,14 کې د مایټوکونډریال اختلال زیاتیدونکي شواهد چمتو کوي. موږ دمخه د ASD ناروغانو په ډله کې د جینوم پراخه DNA میتیلیشن سکرین ترسره کړ او د مایټوکونډریال میټابولیک لارو په اوږدو کې کلستر شوي توپیر لرونکي میتیلیټ شوي جینونه وپیژندل. موږ وروسته د مایټوکونډریال بایوجینیسیس او ډینامیکونو مرکزي تنظیم کونکو توپیر میتیلیشن راپور ورکړ، کوم چې د MtDNA کاپي شمیرې زیاتوالي او په ASD16 کې د ادرار میټابولیک پروفایل بدلولو سره تړاو درلود. زموږ معلومات زیاتیدونکي شواهد وړاندې کوي چې مایټوکونډریال متحرکات او هومیوستاسیس د ASD په پیتوفیزیولوژي کې مرکزي رول لوبوي. له همدې امله، د مایټوکونډریال متحرکاتو، مورفولوژي، او فعالیت ترمنځ د اړیکو میکانیزم پوهاوی ښه کول د ثانوي مایټوکونډریال اختلال لخوا مشخص شوي عصبي ناروغیو په اړه د روانو څیړنو کلیدي هدف دی.
مالیکولي تخنیکونه اکثرا د مایټوکونډریال فشار غبرګونونو کې د ځانګړو جینونو رول مطالعه کولو لپاره کارول کیږي. په هرصورت، دا طریقه ممکن د مایټوټیک کنټرول میکانیزمونو څو اړخیز او لنډمهاله طبیعت لخوا محدوده وي. سربیره پردې، د مایټوکونډریال جینونو توپیري څرګندونه د فعال بدلونونو غیر مستقیم شاخص دی، په ځانګړي توګه ځکه چې یوازې محدود شمیر جینونه معمولا تحلیل کیږي. له همدې امله، د مایټوکونډریال فعالیت او بایو انرجیټکس مطالعې لپاره ډیر مستقیم میتودونه وړاندیز شوي دي17. د مایټوکونډریال مورفولوژي د مایټوکونډریال متحرکاتو سره نږدې تړاو لري. د مایټوکونډریال شکل، ارتباط، او جوړښت د انرژۍ تولید او مایټوکونډریال او حجرو بقا لپاره خورا مهم دي5,18. سربیره پردې، د مایټوسس مختلف اجزا د مایټوکونډریال مورفولوژي کې بدلونونو باندې تمرکز کوي، کوم چې ممکن د مایټوکونډریال اختلال ګټور پای ټکي په توګه کار وکړي او د راتلونکو میخانیکي مطالعاتو لپاره اساس چمتو کړي.
د مایټوکونډریال مورفولوژي په مستقیم ډول د لیږد الکترون مایکروسکوپي (TEM) په کارولو سره لیدل کیدی شي، چې د حجروي الټراسټرکچر تفصيلي مطالعې ته اجازه ورکوي. TEM په مستقیم ډول د انفرادي مایټوکونډریا په حل کې د مایټوکونډریا کریسټای مورفولوژي، شکل او جوړښت تصور کوي، د حجرو نفوس کې یوازې د جین لیږد، پروټین څرګندونه یا مایټوکونډریا فعال پیرامیټرو باندې تکیه کولو پرځای 17,19,20. سربیره پردې، TEM د مایټوکونډریا او نورو ارګانیلونو ترمنځ د تعاملاتو مطالعه اسانه کوي، لکه د انډوپلازمیک ریټیکولم او آټوفاګوزومونه، کوم چې د مایټوکونډریا فعالیت او هومیوستاسیس 21,22 کې کلیدي رول لوبوي. په دې توګه، دا TEM د ځانګړو لارو یا جینونو تمرکز کولو دمخه د مایټوکونډریا اختلال مطالعې لپاره یو ښه پیل ټکی ګرځوي. لکه څنګه چې د مایټوکونډریا فعالیت په زیاتیدونکي توګه د نیوروپیتولوژي سره اړونده کیږي، د دې لپاره روښانه اړتیا شتون لري چې په مستقیم او کمیتي ډول د ان ویټرو نیورونال ماډلونو کې د مایټوکونډریا مورفولوژي او متحرکاتو مطالعه وکړي.
په دې مقاله کې، موږ د اوټیزم سپیکٹرم اختلال کې د مایټوکونډریال اختلال د نیورونال ماډل کې د مایټوکونډریال متحرکات معاینه کوو. موږ دمخه په ASD15 کې د پروپیونیل-CoA کاربوکسیلاز بیټا (PCCB) د توپیر میتیلیشن راپور ورکړی، د مایټوکونډریال پروپیونیل-CoA کاربوکسیلاز انزایم PCC فرعي واحد. د PCC بې نظمي د پروپیونیل مشتقاتو زهرجن راټولیدو لامل کیږي، پشمول د پروپیونیل اسید (PPA)23,24,25. PPA د نیورونال میټابولیزم ګډوډولو او په ویوو کې د چلند بدلولو لپاره ښودل شوی او په ASD26,27,28 کې د نیورو پراختیا میکانیزمونو مطالعې لپاره یو تاسیس شوی څاروی ماډل دی. سربیره پردې، PPA د مایټوکونډریال غشا ظرفیت، بایوجینیسیس او تنفس په ویټرو کې ګډوډولو راپور شوی او په پراخه کچه په نیورونونو کې د مایټوکونډریال اختلال ماډل کولو لپاره کارول شوی 29,30. په هرصورت، د مایټوکونډریال مورفولوژي او متحرکاتو باندې د PPA هڅول شوي مایټوکونډریال اختلال اغیز په کمزوري ډول پوهیدل کیږي.
دا څیړنه د SH-SY5Y حجرو کې د مایټوکونډریال مورفولوژي، متحرکاتو او فعالیت باندې د PPA اغیزو اندازه کولو لپاره د تکمیلي امیجنگ تخنیکونو څخه کار اخلي. لومړی، موږ د TEM میتود رامینځته کړ ترڅو د مایټوکونډریال مورفولوژي او الټراسټرکچر کې بدلونونه لیدل شي17,31,32. د مایټوکونډریال متحرک طبیعت ته په پام سره33، موږ د مایټوکونډریال پیښې ځایی کوونکی (MEL) تحلیل هم وکاروو ترڅو د PPA فشار لاندې د فشن او فیوژن پیښو، د مایټوکونډریال شمیر او حجم ترمنځ توازن کې بدلونونه اندازه کړو. په پای کې، موږ معاینه کړه چې ایا د مایټوکونډریال مورفولوژي او متحرکات د بایوجینیسیس، فشن او فیوژن کې د ښکیلو جینونو په څرګندولو کې د بدلونونو سره تړاو لري. یوځای اخیستل شوي، زموږ معلومات د مایټوکونډریال متحرکاتو تنظیم کولو میکانیزمونو پیچلتیا روښانه کولو ننګونه ښیې. موږ د SH-SY5Y حجرو کې د مایټوکونډریال مورفولوژي مطالعه کولو کې د TEM ګټورتیا روښانه کوو. سربیره پردې، موږ روښانه کوو چې د TEM ډاټا ترټولو بډایه معلومات چمتو کوي کله چې د امیجنگ تخنیکونو سره یوځای شي چې د میټابولیک فشار په ځواب کې متحرک پیښې هم نیسي. د مالیکولي تنظیمي میکانیزمونو نور ځانګړتیا چې د عصبي حجرو مایتوسس ملاتړ کوي ممکن د عصبي سیسټم او عصبي ناروغیو د مایټوکونډریال برخې په اړه مهم بصیرت چمتو کړي.
د مایټوکونډریال فشار د رامینځته کولو لپاره، د SH-SY5Y حجرو درملنه د PPA سره د 3 mM او 5 mM سوډیم پروپیونیټ (NaP) په کارولو سره وشوه. د TEM څخه دمخه، نمونې د لوړ فشار کنګل کولو او کنګل کولو په کارولو سره د کریوجینک نمونې چمتو کولو تابع وې (انځور 1a). موږ د اتوماتیک مایټوکونډریال عکس تحلیل پایپ لاین رامینځته کړ ترڅو د دریو بیولوژیکي نقلونو په اوږدو کې د مایټوکونډریال نفوس اته مورفولوژیکي پیرامیټرې اندازه کړو. موږ وموندله چې د PPA درملنې په څلورو پیرامیټرو کې د پام وړ بدلون راوست: ساحه 2، ساحه، محیط، او د فیریټ قطر (انځور 1b-e). ساحه 2 د 3 mM او 5 mM PPA درملنې سره د پام وړ کمه شوه (په ترتیب سره p = 0.0183 او p = 0.002) (انځور 1b)، پداسې حال کې چې ساحه (p = 0.003)، محیط (p = 0.0106) او د فیریټ قطر ټول د پام وړ کم شوي دي. د کنټرول ګروپ (انځور 1c-e) په پرتله د 5 mM درملنې ګروپ کې د پام وړ کمښت (p = 0.0172) و. په ساحه او محیط کې د پام وړ کمښت ښودلې چې د 5 mM PPA سره درملنه شوي حجرې کوچنۍ، ډیر ګردې مایټوکونډریا درلودې، او دا مایټوکونډریا د کنټرول حجرو په پرتله لږ اوږد شوي وو. دا د فیرټ قطر کې د پام وړ کمښت سره هم مطابقت لري، یو خپلواک پیرامیټر چې د ذراتو څنډو ترمنځ ترټولو لوی واټن کې کمښت په ګوته کوي. د کریسټای په الټراسټرکچر کې بدلونونه لیدل شوي: کریسټای د PPA فشار (انځور 1a، پینل B) تر اغیز لاندې لږ څرګند شو. په هرصورت، ټول انځورونه په واضح ډول د کریسټای الټراسټرکچر منعکس نه کړل، نو د دې بدلونونو کمیتي تحلیل ترسره نه شو. دا TEM معلومات ممکن درې ممکنه سناریوګانې منعکس کړي: (1) PPA انحراف زیاتوي یا فیوژن منع کوي، چې د موجوده مایټوکونډریا د اندازې کمولو لامل کیږي؛ (2) د بایوجینیسیس وده شوې نوې، کوچنۍ مایټوکونډریا رامینځته کوي یا (3) دواړه میکانیزمونه په ورته وخت کې هڅوي. که څه هم دا شرایط د TEM لخوا نشي توپیر کیدی، د پام وړ مورفولوژیکي بدلونونه د PPA فشار لاندې د مایټوکونډریا هومیوستاسیس او ډینامیکونو کې بدلونونه په ګوته کوي. موږ وروسته د دې متحرکاتو او د دوی لاندې احتمالي میکانیزمونو نور مشخص کولو لپاره اضافي پیرامیټرونه وپلټل.
پروپیونیک اسید (PPA) د مایټوکونډریال مورفولوژي بیا رغوي. (a) د استازي لیږد الکترون مایکروسکوپي (TEM) انځورونه ښیې چې د مایټوکونډریال اندازه کمیږي او مایټوکونډریا د PPA درملنې زیاتوالي سره کوچنۍ او ګرد کیږي؛ په ترتیب سره 0 mM (نه درملنه کیږي)، 3 mM او 5 mM. سره تیرونه مایټوکونډریا په ګوته کوي. (b–e) د 24 ساعتونو لپاره د PPA سره درملنه شوي SH-SY5Y حجرې د TEM لپاره چمتو شوي او پایلې د فیجي/ImageJ په کارولو سره تحلیل شوي. د اتو پیرامیټرونو څخه څلورو د کنټرول (نه درملنه کیږي، 0 mM PPA) او درملنه شوي (3 mM او 5 mM PPA) حجرو ترمنځ د پام وړ توپیرونه ښودلي. (b) سیمه 2، (c) ساحه، (d) محیط، (e) د فیرټ قطر. د توپیر یو اړخیز تحلیل (کنټرول په مقابل کې درملنه) او د ډنیټ څو ځله پرتله کولو ازموینه د پام وړ توپیرونو ټاکلو لپاره کارول شوې (p < 0.05). د معلوماتو ټکي د هر انفرادي حجرو لپاره د اوسط مایټوکونډریال ارزښت استازیتوب کوي، او د غلطۍ بارونه د اوسط ± SEM استازیتوب کوي. ښودل شوي معلومات n = 3 ښیي، په هر نقل کې لږترلږه 24 حجرې؛ ټولټال 266 انځورونه تحلیل شوي؛ * د p < 0.05 ښودنه کوي، ** د p < 0.01 ښودنه کوي.
د دې لپاره چې د مایټوکونډریال متحرکات PPA ته څنګه غبرګون ښیې، موږ مایټوکونډریا د ټیټرامیتیلروډامین ایتیل ایسټر (TMRE) سره رنګ کړ او د وخت تیریدو مایکروسکوپي او MEL تحلیل څخه کار واخیست ترڅو د 24 ساعتونو وروسته په 3 او 5 mM PPA کې د مایټوکونډریا ځایی او اندازه کړو. د انحراف او فیوژن پیښو درملنه. (انحراف 2a). د MEL تحلیل وروسته، مایټوکونډریا نور تحلیل شو ترڅو د مایټوکونډریال جوړښتونو شمیر او د دوی اوسط حجم اندازه کړي. موږ د انحراف [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] په پرتله د انحراف پیښو په شمیر کې یو کوچنی مګر د پام وړ زیاتوالی ولید [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] او فیوژن [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] پیښې د کنټرول په پرتله په 5 mM کې د پام وړ زیاتې شوې (انحراف 3b). د مایټوکونډریا شمیر په دواړو 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] او 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (انځور 3c) کې د پام وړ زیاتوالی موندلی، پداسې حال کې چې د هر مایټوکونډریا جوړښت اوسط حجم بدل شوی نه دی (انځور 3c). 3d). په ګډه سره، دا وړاندیز کوي چې د مایټوکونډریا متحرکاتو بیا رغونه د معاوضې غبرګون په توګه کار کوي چې په بریالیتوب سره د مایټوکونډریا شبکې بشپړتیا ساتي. په 3 mM PPA کې د فشن پیښو شمیر کې زیاتوالی وړاندیز کوي چې د مایټوکونډریا شمیر کې زیاتوالی په جزوي ډول د مایټوکونډریا فشن له امله دی، مګر په پام کې نیولو سره چې د مایټوکونډریا اوسط حجم په اصل کې بدل شوی نه دی، بایوجینیسیس د اضافي معاوضې غبرګون په توګه رد کیدی نشي. په هرصورت، دا معلومات د TEM لخوا لیدل شوي کوچني، ګرد مایټوکونډریا جوړښتونو سره مطابقت لري او د PPA لخوا رامینځته شوي مایټوکونډریا متحرکاتو کې د پام وړ بدلونونه هم ښیې.
پروپیونیک اسید (PPA) د شبکې بشپړتیا ساتلو لپاره متحرک مایټوکونډریال بیا رغونه هڅوي. SH-SY5Y حجرې د 24 ساعتونو لپاره د 3 او 5 mM PPA سره درملنه شوې، او د TMRE او Hoechst 33342 سره رنګ شوي او وروسته د MEL تحلیل. (a) د هر حالت لپاره د وخت 2 (t2) په وخت کې د رنګ او بائنریز شوي اعظمي شدت اټکلونو استازیتوب کونکي د وخت تیریدو مایکروسکوپي انځورونه. په هر بائنری عکس کې ښودل شوي غوره شوي سیمې ښه شوي او په 3D کې په دریو مختلفو وخت چوکاټونو (t1-t3) کې ښودل شوي ترڅو د وخت په تیریدو سره متحرکات روښانه کړي؛ د فیوژن پیښې په شنه رنګ کې روښانه شوي؛ د فیوژن پیښې په شنه رنګ کې روښانه شوي. په سور رنګ کې ښودل شوي. (b) د هر حالت لپاره د متحرک پیښو اوسط شمیر. (c) د هر حجرې لپاره د مایټوکونډریال جوړښتونو اوسط شمیر. (d) د هر حجرې لپاره د هر مایټوکونډریال جوړښت اوسط حجم (µm3). ښودل شوي معلومات د درملنې ګروپ لپاره د n = 15 حجرو استازیتوب کوي. ښودل شوي غلطۍ بارونه د اوسط ± SEM، پیمانه بار = 10 μm، * p < 0.05 استازیتوب کوي.
پروپیونیک اسید (PPA) د مایټوکونډریال متحرکاتو سره تړلي جینونو د ټرانسکرپشنل فشار لامل کیږي. د SH-SY5Y حجرو د 24 ساعتونو لپاره د 3 او 5 mM PPA سره درملنه وشوه. د RT-qPCR په کارولو سره د نسبي جین اندازه کول ترسره شول او B2M ته نورمال شول. د مایټوکونډریال بایوجینیسیس جینونه (a) cMYC، (b) TFAM، (c) NRF1 او (d) NFE2L2. د مایټوکونډریال فیوژن او فیژن جینونه (e) STOML2، (f) OPA1، (g) MFN1، (h) MFN2 او (i) DRP1. د پام وړ توپیرونه (p < 0.05) د یو اړخیز ANOVA (کنټرول په مقابل کې د درملنې) او د ډنیټ د څو پرتلنې ازموینې په کارولو سره ازمول شوي: * p < 0.05 ښیې، ** p < 0.01 ښیې، او **** p < 0.0001 ښیې. بارونه د اوسط اظهار ± SEM استازیتوب کوي. ښودل شوي معلومات n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM)، n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2)، او n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) بیولوژیکي نقلونه استازیتوب کوي.
د TEM او MEL تحلیلونو څخه معلومات په ګډه ښیي چې PPA د مایټوکونډریال مورفولوژي او متحرکاتو بدلوي. په هرصورت، دا امیجنگ تخنیکونه د دې پروسو چلولو اصلي میکانیزمونو په اړه بصیرت نه وړاندې کوي. له همدې امله موږ د PPA درملنې په ځواب کې د مایټوکونډریال متحرکاتو، بایوجینیسیس، او مایټوسس د نهو کلیدي تنظیم کونکو mRNA څرګندونه معاینه کړه. موږ د حجرو مایلوما آنکوجین (cMYC)، اټومي تنفسي فاکتور (NRF1)، مایټوکونډریال ټرانسکرپشن فاکتور 1 (TFAM)، NFE2 په څیر ټرانسکرپشن فاکتور BZIP (NFE2L2)، د ګیسټرین په څیر پروټین 2 (STOML2)، د آپټیک اعصاب اتروفي 1 (OPA1)، میټوفوسین 1 (MFN1)، میټوفوسین 2 (MFN2) او ډینامین پورې اړوند پروټین 1 (DRP1) د 3 mM او 5 mM PPA سره د 24 ساعتونو درملنې وروسته اندازه کړل. موږ د 3 ملي میتر (p = 0.0053، p = 0.0415 او p < 0.0001، په ترتیب سره) او 5 ملي میتر (p = 0.0031، p = 0.0233، p < 0.0001) PPA درملنه ولیدله. (انځور 3a–c). د mRNA اظهار کموالی د خوراک پورې اړه لري: د cMYC، NRF1 او TFAM څرګندتیا په ترتیب سره په 3 ملي میتر کې 5.7، 2.6 او 1.9 ځله کمه شوې، او په 5 ملي میتر کې 11.2، 3 او 2.2 ځله کمه شوې. برعکس، د مرکزي ریډوکس بایوجینیسیس جین NFE2L2 د PPA په هیڅ غلظت کې بدلون نه دی راغلی، که څه هم د کمښت د خوراک پورې تړلی رجحان لیدل شوی (انځور 3d).
موږ د کلاسیک جینونو څرګندونه هم وڅیړله چې د فیوژن او فیوژن تنظیم کې ښکیل دي. STOML2 فکر کیږي چې په فیوژن، مایټوفګي او بایوجینیسیس کې ښکیل دی، او د هغې څرګندونه د پام وړ کمه شوې (p < 0.0001) د 3 mM (2.4-fold بدلون) او 5 mM (2.8-fold بدلون) PPA (شکل 1). 3d). په ورته ډول، د OPA1 فیوژن جین څرګندونه په 3 mM (1.6-fold بدلون) او 5 mM (1.9-fold بدلون) PPA (p = 0.006 او p = 0.0024، په ترتیب سره) کې کمه شوې (شکل 3f). په هرصورت، موږ د فیوژن جینونو MFN1، MFN2 یا فیوژن جین DRP1 په څرګندولو کې د 24-h PPA فشار لاندې د پام وړ توپیرونه ونه موندل (شکل 3g–i). سربیره پردې، موږ وموندله چې د څلورو فیوژن او فیژن پروټینونو کچه (OPA1، MFN1، MFN2 او DRP1) د ورته شرایطو لاندې بدلون نه دی موندلی (انځور 4a-d). دا مهمه ده چې په یاد ولرئ چې دا معلومات په وخت کې یو واحد ټکی منعکس کوي او ممکن د PPA فشار په لومړیو مرحلو کې د پروټین څرګندونې یا د فعالیت کچې کې بدلونونه منعکس نه کړي. په هرصورت، د cMYC، NRF1، TFAM، STOML2، او OPA1 په څرګندولو کې د پام وړ کمښت د مایټوکونډریال میټابولیزم، بایوجینیسیس، او ډینامیکونو د پام وړ ټرانسکرپشنل ډیس ریګولیشن په ګوته کوي. سربیره پردې، دا معلومات د مایټوکونډریال فعالیت کې د پای حالت بدلونونو مستقیم مطالعه کولو لپاره د عکس اخیستنې تخنیکونو ګټورتیا روښانه کوي.
د پروپیونیک اسید (PPA) درملنې وروسته د فیوژن او فیژن فکتور پروټین کچه بدله نه شوه. د SH-SY5Y حجرو درملنه د 24 ساعتونو لپاره د 3 او 5 mM PPA سره وشوه. د پروټین کچه د لویدیځ بلاټ تحلیل لخوا اندازه شوې، او د څرګندولو کچه د ټول پروټین ته نورمال شوې. د پروټین اوسط څرګندونه او د هدف او ټول پروټین استازي لویدیځ بلاټ ښودل شوي. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. بارونه د اوسط ± SEM استازیتوب کوي، او ښودل شوي معلومات د n = 3 بیولوژیکي نقلونو استازیتوب کوي. ډیری پرتله کول (p < 0.05) د تغیراتو او د ډنیټ ازموینې د یو اړخیز تحلیل په کارولو سره ترسره شوي. اصلي جیل او بلاټ په شکل S1 کې ښودل شوي.
د مایټوکونډریال اختلال د څو سیسټم ناروغیو سره تړاو لري چې د میټابولیک، زړه او عضلاتو ناروغیو څخه نیولې تر عصبي ناروغیو پورې دي 1,10. ډیری عصبي او عصبي اختلال ناروغۍ د مایټوکونډریال اختلال سره تړاو لري، چې د دماغ د ټول عمر په اوږدو کې د دې ارګانیلونو اهمیت روښانه کوي. پدې ناروغیو کې د پارکنسن ناروغي، الزایمر ناروغي او ASD3,4,18 شامل دي. په هرصورت، د دې ناروغیو د مطالعې لپاره د دماغ نسج ته لاسرسی ستونزمن دی، په ځانګړې توګه په میخانیکي کچه، د حجروي ماډل سیسټمونه یو اړین بدیل جوړوي. پدې څیړنه کې، موږ د PPA درملنې SH-SY5Y حجرو په کارولو سره د حجروي ماډل سیسټم کاروو ترڅو د عصبي ناروغیو، په ځانګړي توګه د آټیزم سپیکٹرم اختلالاتو کې لیدل شوي مایټوکونډریال اختلال بیاکتنه وکړو. په نیورونونو کې د مایټوکونډریال متحرکاتو مطالعې لپاره د دې PPA ماډل کارول ممکن د ASD ایټیولوژي کې بصیرت چمتو کړي.
موږ د مایټوکونډریال مورفولوژي کې د بدلونونو لیدلو لپاره د TEM کارولو امکان وپلټلو. دا مهمه ده چې په یاد ولرئ چې TEM باید په سمه توګه وکارول شي ترڅو د هغې اغیزمنتوب اعظمي شي. د کریو نمونو چمتو کول د عصبي جوړښتونو ښه ساتنې ته اجازه ورکوي چې په ورته وخت کې د حجروي اجزاو تنظیم کولو او د هنري اثارو جوړښت کمولو سره 34. د دې سره سم، موږ ولیدل چې د نیورون په څیر SH-SY5Y حجرو بشپړ فرعي حجروي ارګانیلونه او اوږد شوي مایټوکونډریا درلودل (شکل 1a). دا د نیورونال حجرو ماډلونو کې د مایټوکونډریال مورفولوژي مطالعې لپاره د کریوجینک چمتووالي تخنیکونو ګټورتیا روښانه کوي. که څه هم کمیتي اندازه کول د TEM معلوماتو د عین تحلیل لپاره خورا مهم دي، لاهم پدې اړه هیڅ اجماع شتون نلري چې د مایټوکونډریال مورفولوژي بدلونونو تایید لپاره کوم ځانګړي پیرامیټرې باید اندازه شي. د ډیری مطالعاتو پراساس چې په کمیتي ډول د مایټوکونډریال مورفولوژي معاینه کړې 17,31,32، موږ د اتوماتیک مایټوکونډریال عکس تحلیل پایپ لاین رامینځته کړی چې اته مورفولوژیکي پیرامیټرې اندازه کوي، لکه: ساحه، ساحه 2، د اړخ تناسب، محیط، ګردوالی، درجې، فیرټ قطر. او ګردوالی.
د دوی په منځ کې، PPA د پام وړ ساحه 2، ساحه، محیط، او د فیریټ قطر کم کړ (انځور 1b–e). دا وښودله چې مایټوکونډریا کوچنۍ او ګرده شوه، کوم چې د پخوانیو مطالعاتو سره سمون لري چې د PPA30- هڅول شوي مایټوکونډریا فشار 72 ساعتونو وروسته د مایټوکونډریا ساحه کې کمښت ښیې. دا مورفولوژیکي ځانګړتیاوې ممکن د مایټوکونډریا فشن په ګوته کړي، د مایټوکونډریا شبکې څخه د زیانمن شوي اجزاو جلا کولو لپاره یو اړین پروسه ترڅو د مایټوفاګي 35,36,37 له لارې د دوی تخریب ته وده ورکړي. له بلې خوا، د اوسط مایټوکونډریا اندازې کمښت ممکن د بایوجینیسیس زیاتوالي سره تړاو ولري، کوم چې د کوچني نوي مایټوکونډریا رامینځته کیدو پایله لري. د فشن یا بایوجینیسیس زیاتوالی د مایټوکونډریا فشار پروړاندې د مایټوسس ساتلو لپاره د جبران غبرګون استازیتوب کوي. په هرصورت، د مایټوکونډریا وده کمه شوې، خراب شوی فیوژن، یا نور شرایط نشي رد کیدی.
که څه هم د TEM لخوا رامینځته شوي لوړ ریزولوشن عکسونه د انفرادي مایټوکونډریا په کچه د مورفولوژیکي ځانګړتیاو ټاکلو ته اجازه ورکوي، دا طریقه په یوه وخت کې دوه اړخیز سنیپ شاټونه تولیدوي. د میټابولیک فشار ته د متحرک غبرګونونو مطالعې لپاره، موږ مایټوکونډریا د TMRE سره رنګ کړ او د MEL تحلیل سره د وخت تیریدلو مایکروسکوپي وکاروو، کوم چې د وخت په تیریدو سره د مایټوکونډریا شبکې کې د بدلونونو لوړ تروپټ 3D لید ته اجازه ورکوي 33,38. موږ د PPA فشار لاندې د مایټوکونډریا متحرکاتو کې فرعي مګر د پام وړ بدلونونه ولیدل (شکل 2). په 3 mM کې، د فشن پیښو شمیر د پام وړ زیات شو، پداسې حال کې چې د فیوژن پیښې د کنټرول په څیر پاتې شوې. د فشن او فیوژن پیښو په شمیر کې زیاتوالی په 5 mM PPA کې لیدل شوی، مګر دا بدلونونه نږدې متناسب وو، وړاندیز کوي چې فشن او فیوژن کینیټکس په لوړ غلظت کې توازن ته رسیږي (شکل 2b). د مایټوکونډریا اوسط حجم په 3 او 5 mM PPA دواړو کې بدل نه شو، دا په ګوته کوي چې د مایټوکونډریا شبکې بشپړتیا ساتل شوې وه (شکل 2d). دا د متحرک مایټوکونډریال شبکو وړتیا منعکس کوي چې د نرم میټابولیک فشار ته ځواب ووایی ترڅو په مؤثره توګه هومیوستاسیس وساتي پرته لدې چې د شبکې ټوټې کیدو لامل شي. په 3 mM PPA کې، د انشقاق زیاتوالی د نوي توازن ته د لیږد هڅولو لپاره کافي دی، مګر د PPA د لوړ غلظت لخوا رامینځته شوي فشار په ځواب کې ډیر ژور کاینټیک بیا رغونه اړینه ده.
د مایټوکونډریا شمیر د PPA فشار په دواړو غلظتونو کې زیات شو، مګر د مایټوکونډریا اوسط حجم د پام وړ بدلون نه دی راوستی (انځور 2c). دا ممکن د بایوجینیسیس زیاتوالي یا د ویش زیاتوالي له امله وي؛ په هرصورت، د مایټوکونډریا په اوسط حجم کې د پام وړ کمښت په نشتوالي کې، دا ډیر احتمال لري چې بایوسینتیسس زیات شي. په هرصورت، په شکل 2 کې معلومات د دوو جبران میکانیزمونو شتون ملاتړ کوي: د فشن پیښو شمیر کې زیاتوالی، د مایټوکونډریا فشن لوړولو سره مطابقت لري، او د پیښو شمیر کې زیاتوالی، د مایټوکونډریا بایوجینیسیس سره مطابقت لري. په نهایت کې، د معتدل فشار لپاره متحرک جبران ممکن د فشن، فیوژن، بایوجینیسیس، او میټوفیګي په ګډون یوځای پروسې ولري. که څه هم پخوانیو لیکوالانو ښودلې چې PPA مایټوسس 30,39 او میټوفیګي 29 زیاتوي، موږ د PPA په ځواب کې د مایټوکونډریا فشن او فیوژن متحرکاتو بیا رغولو لپاره شواهد چمتو کوو. دا معلومات د TEM لخوا لیدل شوي مورفولوژیکي بدلونونه تاییدوي او د PPA هڅول شوي مایټوکونډریا اختلال سره تړلي میکانیزمونو ته نور بصیرت چمتو کوي.
ځکه چې نه TEM او نه هم MEL تحلیل د جین تنظیمي میکانیزمونو مستقیم شواهد وړاندې کړل چې د مشاهده شوي مورفولوژیکي بدلونونو لاندې دي، موږ د جینونو د RNA څرګندونه معاینه کړه چې د مایټوکونډریال میټابولیزم، بایوجینیسیس، او ډینامیک کې ښکیل دي. cMYC پروټو-آنکوګین د مایټوکونډریال، ګلایکولیسس، امینو اسید او غوړ اسید میټابولیزم تنظیم کولو کې دخیل یو نقل فاکتور دی. سربیره پردې، cMYC د نږدې 600 مایټوکونډریال جینونو څرګندونه تنظیمولو لپاره پیژندل کیږي چې د مایټوکونډریال لیږد، ژباړې، او پیچلي اسمبلۍ کې ښکیل دي، پشمول د NRF1 او TFAM41. NRF1 او TFAM د مایټوسس دوه مرکزي تنظیم کونکي دي، د PGC-1α لاندې عمل کوي ترڅو د mtDNA نقل فعال کړي. دا لاره د cAMP او AMPK سیګنالینګ لخوا فعاله شوې او د انرژۍ لګښت او میټابولیک فشار سره حساسه ده. موږ NFE2L2 هم معاینه کړ، د مایټوکونډریال بایوجینیسیس ریډوکس تنظیم کونکی، ترڅو معلومه کړو چې ایا د PPA اغیزې ممکن د اکسیډیټیو فشار لخوا منځګړیتوب شي.
که څه هم د NFE2L2 څرګندونه بدله نه شوه، موږ د 3 mM او 5 mM PPA سره د 24 ساعتونو درملنې وروسته د cMYC، NRF1 او TFAM څرګندونه کې د خوراک پورې تړلې دوامداره کمښت وموند (انځور 3a–c). د cMYC څرګندونه کمول دمخه د مایټوکونډریال فشار 42 ته د ځواب په توګه راپور شوي، او برعکس، د cMYC څرګندونه کمول کولی شي د مایټوکونډریال میټابولیزم، شبکې ارتباط، او د غشا قطبي کولو 43 بیا رغولو له لارې د مایټوکونډریال اختلال لامل شي. په زړه پورې خبره دا ده چې cMYC د مایټوکونډریال فشن او فیوژن 42،43 تنظیم کې هم دخیل دی او د حجرو ویش 44 په جریان کې د DRP1 فاسفوریلیشن او مایټوکونډریال ځایی کولو زیاتولو لپاره پیژندل کیږي، او همدارنګه د نیورونال سټیم حجرو کې د مایټوکونډریال مورفولوژیکي بیا رغونه منځګړیتوب کوي 45. په حقیقت کې، د cMYC کمښت لرونکي فایبروبلاستونه د مایټوکونډریال اندازه کمه ښیې، د PPA43 فشار لخوا رامینځته شوي بدلونونو سره سم. دا معلومات د cMYC او مایټوکونډریال متحرکاتو ترمنځ یو په زړه پورې مګر لاهم ناڅرګنده اړیکه ښیې، چې د PPA فشار هڅول شوي بیا رغولو راتلونکي مطالعاتو لپاره یو په زړه پورې هدف چمتو کوي.
د NRF1 او TFAM کمښت د cMYC د رول سره د یو مهم ټرانسکرپشنل فعالونکي په توګه مطابقت لري. دا معلومات د انسانانو د کولمو سرطان حجرو کې د پخوانیو مطالعاتو سره هم مطابقت لري چې ښیې PPA په 22 ساعتونو کې د NRF1 mRNA څرګندونه کمه کړې، کوم چې د ATP کمښت سره تړاو درلود او ROS46 یې زیات کړ. دې لیکوالانو دا هم راپور ورکړی چې د TFAM څرګندونه په 8.5 ساعتونو کې زیاته شوې مګر په 22 ساعتونو کې بیرته اساسی کچې ته راستون شوې. برعکس، Kim et al. (2019) ښودلې چې د SH-SY5Y حجرو کې د PPA فشار 4 ساعتونو وروسته د TFAM mRNA څرګندونه د پام وړ کمه شوې وه؛ په هرصورت، د 72 ساعتونو وروسته، د TFAM پروټین څرګندونه د پام وړ زیاته شوې او د mtDNA کاپي شمیره د پام وړ زیاته شوې. په دې توګه، د مایټوکونډریال بایوجینیسیس جینونو په شمیر کې کمښت چې موږ یې د 24 ساعتونو وروسته مشاهده کړې دا امکان نه ردوي چې د مایټوکونډریال په شمیر کې زیاتوالی د پخوانیو وختونو کې د بایوجینیسیس فعالولو سره تړاو لري. پخوانیو مطالعاتو ښودلې چې PPA د SH-SY5Y حجرو کې د PGC-1α mRNA او پروټین د پام وړ لوړولو لپاره په 4 ساعتونو او 30 دقیقو کې کار کوي، پداسې حال کې چې پروپیونیک اسید د 12 ساعتونو او 39 دقیقو کې د PGC-1α له لارې د خوسکي هیپاټوسایټونو کې د مایټوکونډریال بایوجینیسیس ته وده ورکوي. په زړه پورې خبره دا ده چې PGC-1α نه یوازې د NRF1 او TFAM مستقیم ټرانسکرپشن تنظیم کونکی دی، بلکه د فشن او فیوژن تنظیم کولو له لارې د MFN2 او DRP1 فعالیت تنظیم کولو لپاره هم ښودل شوی 47. په ګډه سره، دا د PPA لخوا رامینځته شوي مایټوکونډریال معاوضې غبرګونونو تنظیم کولو میکانیزمونو نږدې جوړه روښانه کوي. سربیره پردې، زموږ معلومات د PPA فشار لاندې د بایوجینیسیس او میټابولیزم د ټرانسکرپشن تنظیم کولو کې د پام وړ ګډوډي منعکس کوي.
STOML2، OPA1، MFN1، MFN2 او DRP1 جینونه د مایټوکونډریال فشن، فیوژن او ډینامیکس مرکزي تنظیم کونکو څخه دي 37,48,49. په مایټوکونډریال ډینامیکس کې ډیری نور جینونه ښکیل دي، په هرصورت، STOML2، OPA1 او MFN2 دمخه په ASD کوهورټونو کې په متفاوت ډول میتیلیټ شوي موندل شوي، 16 او ډیری خپلواکو مطالعاتو د مایټوکونډریال فشار 50,51 په ځواب کې د دې نقل کولو فکتورونو کې بدلونونه راپور کړي دي. 52. د OPA1 او STOML2 دواړو څرګندونه د 3 mM او 5 mM PPA درملنې لخوا د پام وړ کمه شوې وه (انځور 3e، f). OPA1 د MFN1 او 2 سره مستقیم تعامل له لارې د مایټوکونډریال فیوژن یو له کلاسیک تنظیم کونکو څخه دی او د کریسټا بیا جوړونې او مایټوکونډریال مورفولوژي کې رول لوبوي 53. د مایټوکونډریال ډینامیکس کې د STOML2 دقیق رول روښانه نه دی، مګر شواهد وړاندیز کوي چې دا د مایټوکونډریال فیوژن، بایوجینیسیس، او میټوفاګي کې رول لوبوي.
STOML2 د مایټوکونډریال تنفسي یوځای کولو او د تنفسي زنځیرونو پیچلتیاو په جوړولو کې دخیل دی54,55 او ښودل شوي چې د سرطان حجرو میټابولیک ځانګړتیاوې په ژوره توګه بدلوي56. مطالعاتو ښودلې چې STOML2 د BAN او کارډیولیپین 55,57,58 سره د تعامل له لارې د مایټوکونډریال غشا ظرفیت او بایوجینیسیس ته وده ورکوي. سربیره پردې، خپلواکو مطالعاتو ښودلې چې د STOML2 او PINK1 ترمنځ تعامل د مایټوفاګي59,60 تنظیموي. د پام وړ، STOML2 راپور ورکړل شوی چې په مستقیم ډول د MFN2 سره تعامل او ثبات کوي او همدارنګه د OPA1 تخریب لپاره مسؤل پروټیز مخنیوي سره د اوږدې OPA1 isoforms ثبات کې مهم رول لوبوي53,61,62. د PPA تعاملاتو کې لیدل شوي د STOML2 څرګندونې کمښت ممکن دا فیوژن پروټینونه د ubiquitin- او پروټیزوم پورې تړلو لارو له لارې د تخریب لپاره ډیر حساس کړي48. که څه هم د PPA په وړاندې د متحرک غبرګون کې د STOML2 او OPA1 دقیق رول روښانه نه دی، د دې فیوژن جینونو کم شوی څرګندونه (شکل 3) ممکن د فیوژن او فیوژن ترمنځ توازن ګډوډ کړي او د مایټوکونډریا اندازې کمیدو لامل شي (شکل 3). 1).
له بلې خوا، د OPA1 پروټین څرګندونه د 24 ساعتونو وروسته بدله پاتې شوه، پداسې حال کې چې د MFN1، MFN2 یا DRP1 د mRNA او پروټین کچه د PPA درملنې وروسته د پام وړ بدلون نه دی راغلی (انځور 3g-i، شکل 4). دا ممکن په ګوته کړي چې د مایټوکونډریال فیوژن او فیژن کې دخیل د دې فکتورونو تنظیم کې هیڅ بدلون شتون نلري. په هرصورت، دا د یادونې وړ ده چې د دې څلورو جینونو څخه هر یو د پوسټ ټرانسکرپشنل تعدیلاتو (PTMs) لخوا هم تنظیم کیږي چې د پروټین فعالیت کنټرولوي. OPA1 اته بدیل سپلیس ډولونه لري چې په مایټوکونډریا کې په پروټیولیټیک ډول ویشل شوي ترڅو دوه جلا ایزوفارمونه تولید کړي 63. د اوږد او لنډ ایزوفارمونو ترمنځ توازن په نهایت کې د مایټوکونډریال فیوژن او د مایټوکونډریال شبکې ساتنه کې د OPA1 رول ټاکي64. د DRP1 فعالیت د کلسیم/کالموډولین پورې تړلي پروټین کایناز II (CaMKII) فاسفوریلیشن لخوا تنظیم کیږي، پداسې حال کې چې د DRP1 تخریب د ubiquitination او SUMOylation65 لخوا تنظیم کیږي. په پای کې، دواړه DRP1 او MFN1/2 GTPases دي، نو فعالیت ممکن د مایټوکونډریا 66 کې د GTP تولید کچه لخوا اغیزمن شي. له همدې امله، که څه هم د دې پروټینونو څرګندونه ثابته پاتې کیږي، دا ممکن د پروټین فعالیت یا ځایی کولو بدلون منعکس نکړي 67،68. په حقیقت کې، د PTM موجوده پروټین ذخیره ډیری وختونه د حاد فشار غبرګونونو منځګړیتوب لپاره مسؤل د دفاع لومړۍ کرښې په توګه کار کوي. زموږ په ماډل کې د معتدل میټابولیک فشار په شتون کې، دا احتمال لري چې PTM د فیوژن او فیژن پروټینونو زیات فعالیت ته وده ورکړي ترڅو د mRNA یا پروټین په کچه د دې جینونو اضافي فعالولو ته اړتیا پرته د مایټوکونډریا بشپړتیا په کافي اندازه بحال کړي.
په ګډه سره، پورته معلومات د مایټوکونډریال مورفولوژي پیچلي او وخت پورې تړلي تنظیم او د دې میکانیزمونو د روښانه کولو ننګونې روښانه کوي. د جین څرګندولو مطالعې لپاره، لومړی دا اړینه ده چې په لاره کې ځانګړي هدف جینونه وپیژنو. په هرصورت، زموږ معلومات ښیې چې په ورته لاره کې جینونه ورته فشار ته په ورته ډول ځواب نه ورکوي. په حقیقت کې، پخوانیو مطالعاتو ښودلې چې په ورته لاره کې مختلف جینونه ممکن د وخت په تیریدو سره مختلف غبرګون پروفایلونه ښکاره کړي 30,46. سربیره پردې، د لیږد وروسته پیچلي میکانیزمونه شتون لري چې د لیږد او جین فعالیت ترمنځ اړیکه ګډوډوي. پروټومیک مطالعات کولی شي د PTMs او پروټین فعالیت اغیزې په اړه بصیرت چمتو کړي، مګر دوی د ټیټ-تروپټ میتودونو، لوړ سیګنال-ټو-شور تناسب، او ضعیف ریزولوشن په شمول ننګونې هم رامینځته کوي.
په دې شرایطو کې، د TEM او MEL په کارولو سره د مایټوکونډریال مورفولوژي مطالعه د مایټوکونډریال متحرکاتو او فعالیت ترمنځ د اړیکو او دا چې دا څنګه ناروغي اغیزه کوي د بنسټیزو پوښتنو د حل کولو لپاره لوی ظرفیت لري. تر ټولو مهم، TEM د مایټوکونډریال اختلال او متحرکاتو د متقابل پای نقطې په توګه د مایټوکونډریال مورفولوژي اندازه کولو لپاره مستقیم میتود چمتو کوي51. MEL د درې اړخیز حجروي چاپیریال کې د فشن او فیوژن پیښو لیدو لپاره مستقیم میتود هم چمتو کوي، د جین څرګندولو کې د بدلونونو په نشتوالي کې حتی د متحرک مایټوکونډریال بیا جوړونې اندازه کولو ته اجازه ورکوي33. دلته موږ د ثانوي مایټوکونډریال ناروغیو کې د مایټوکونډریال امیجنگ تخنیکونو ګټورتوب روښانه کوو. دا ناروغۍ معمولا د اوږدمهاله نرم میټابولیک فشار لخوا مشخص کیږي چې د مایټوکونډریال شبکو د فرعي بیا جوړونې لخوا مشخص کیږي د حاد مایټوکونډریال زیان پرځای. په هرصورت، د اوږدمهاله فشار لاندې د مایټوسس ساتلو لپاره اړین مایټوکونډریال تاوان ژور فعال پایلې لري. د عصبي ساینس په شرایطو کې، د دې جبران میکانیزمونو ښه پوهه ممکن د مایټوکونډریال اختلال سره تړلي پلیوټروپیک نیوروپیتولوژي په اړه مهم معلومات چمتو کړي.
په پای کې، زموږ معلومات د جین څرګندولو، پروټین بدلونونو، او پروټین فعالیت ترمنځ د پیچلو تعاملاتو د فعال پایلو د پوهیدو لپاره د امیجنگ تخنیکونو ګټورتیا روښانه کوي چې د نیورونال مایټوکونډریال متحرکاتو کنټرول کوي. موږ د ASD د مایټوکونډریال برخې په اړه بصیرت ترلاسه کولو لپاره د نیورونال حجرو ماډل کې د مایټوکونډریال اختلال ماډل کولو لپاره PPA وکاروو. د PPA سره درملنه شوي SH-SY5Y حجرې د مایټوکونډریال مورفولوژي کې بدلونونه وښودل: مایټوکونډریا کوچنۍ او ګرده شوه، او کریسټا په کمزوري ډول تعریف شوې کله چې د TEM لخوا مشاهده کیږي. د MEL تحلیل ښیې چې دا بدلونونه د فشن او فیوژن پیښو زیاتوالي سره په ورته وخت کې پیښیږي ترڅو د معتدل میټابولیک فشار په ځواب کې د مایټوکونډریال شبکې ساتنه وشي. سربیره پردې، PPA د مایټوکونډریال میټابولیزم او هوموستاسیس د ټرانسکرپشن تنظیم په پام کې نیسي. موږ cMYC، NRF1، TFAM، STOML2، او OPA1 د PPA فشار لخوا ګډوډ شوي د کلیدي مایټوکونډریال تنظیم کونکو په توګه پیژندلي او ممکن د مایټوکونډریال مورفولوژي او فعالیت کې د PPA هڅول شوي بدلونونو منځګړیتوب کې رول ولوبوي. راتلونکي مطالعاتو ته اړتیا ده ترڅو د جین څرګندولو او پروټین فعالیت، ځایی کولو، او د ژباړې وروسته بدلونونو کې د PPA هڅول شوي لنډمهاله بدلونونه ښه مشخص کړي. زموږ معلومات د مایټوکونډریال فشار غبرګون منځګړیتوب کونکي تنظیمي میکانیزمونو پیچلتیا او متقابل تړاو روښانه کوي او د ډیر هدفمند میخانیکي مطالعاتو لپاره د TEM او نورو امیجنگ تخنیکونو ګټورتوب ښیې.
د SH-SY5Y حجرو لاین (ECACC, 94030304-1VL) د سیګما-الډریچ څخه اخیستل شوی و. د SH-SY5Y حجرې د ډولبیکو په تعدیل شوي ایګل میډیم/F-12 مغذي مخلوط (DMEM/F-12) او L-ګلوټامین (SC09411, ScienCell) کې په 25 cm2 فلاسکونو کې کرل شوي چې د 20٪ جنین غواګانو سیرم (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) او 1٪ پنسلین-سټریپټومایسین (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) سره ضمیمه شوي په 37 °C، 5٪ CO2 کې. حجرات د 0.05٪ ټریپسین-EDTA (15400054، ThermoFisher Scientific) په کارولو سره د 80٪ کنفلوئنس ته فرعي کرل شوي وو، په 300 ګرامه کې سینټرفیوج شوي او د نږدې 7 × 105 حجرو/ml کثافت سره پلیټ شوي وو. ټولې تجربې د 19-22 د پاسونو ترمنځ په غیر متفاوت SH-SY5Y حجرو باندې ترسره شوې. PPA د NaP په توګه اداره کیږي. د NaP پوډر (CAS نمبر 137-40-6، کیمیاوي فورمول C3H5NaO2، P5436-100G، سیګما-الډریچ) په ګرمو ملی کیو اوبو کې د 1 M غلظت ته حل کړئ او په 4 °C کې ذخیره کړئ. د درملنې په ورځ، دا محلول د 1 M PPA څخه تر 3 mM پورې او د 5 mM PPA سره د سیرم فری میډیم (DMEM/F-12 د L-glutamine سره) کې حل کړئ. د ټولو تجربو لپاره د درملنې غلظت هیڅ PPA (0 mM، کنټرول)، 3 mM، او 5 mM PPA نه وو. تجربې لږترلږه په دریو بیولوژیکي نقلونو کې ترسره شوې.
د SH-SY5Y حجرات د 5.5 × 105 حجرو/ml په اندازه په 25 cm5 فلاسکونو کې تخم شوي او د 24 ساعتونو لپاره کرل شوي. د PPA درملنه د 24 ساعتونو د انکیوبیشن څخه دمخه فلاسک ته اضافه شوه. د عادي تی لرونکو نسجونو فرعي کلتور پروتوکولونو په تعقیب د حجرو ګولۍ راټول کړئ (پورته تشریح شوي). د حجرو ګولۍ په 100 µl 2.5٪ ګلوټارالډیهایډ، 1× PBS کې بیا ځړول او د پروسس کولو پورې په 4 °C کې ذخیره کړئ. SH-SY5Y حجرات په لنډه توګه سینټرفیوج شوي ترڅو حجرات ګولۍ کړي او 2.5٪ ګلوټارالډیهایډ، 1× PBS محلول لرې کړي. رسوبات په 4٪ اګاروز جیل کې چې په تشو اوبو کې چمتو شوی وي بیا ځړول (د اګاروز تناسب د رسوب حجم 1:1 دی). د اګاروز ټوټې په فلیټ پلیټونو کې په ګریډونو کې ځای په ځای شوي او د لوړ فشار کنګل کولو دمخه د 1-هیکساډیسین سره پوښل شوي. نمونې د 24 ساعتونو لپاره په -90 °C کې په 100٪ وچ اسیټون کې کنګل شوي. بیا تودوخه -۸۰ درجو سانتي ګراد ته لوړه شوه او د ۱٪ اوسمیم ټیټروکسایډ او ۰.۱٪ ګلوټارالډیهایډ محلول اضافه شو. نمونې د ۲۴ ساعتونو لپاره په -۸۰ درجو سانتي ګراد کې زیرمه شوې. له دې وروسته، تودوخه په تدریجي ډول د څو ورځو په اوږدو کې د خونې تودوخې ته لوړه شوه: د ۲۴ ساعتونو لپاره -۸۰ درجو سانتي ګراد څخه -۵۰ درجو سانتي ګراد ته، د ۲۴ ساعتونو لپاره -۳۰ درجو سانتي ګراد ته، د ۲۴ ساعتونو لپاره -۱۰ درجو سانتي ګراد ته او په پای کې د خونې تودوخې ته.
د کریوجینک چمتووالي وروسته، نمونې د رال سره رنګ شوي او د لایکا ریچارټ الټراکټ ایس الټرا مایکروټوم (لایکا مایکروسیسټم) په کارولو سره د الټرا پتلو برخو (~100 nm) جوړ شوي. برخې د 2٪ یورانیل اسټیټ او لیډ سیټریټ سره رنګ شوي. نمونې د FEI Tecnai 20 لیږد الکترون مایکروسکوپ (ترمو فشر (پخوانی FEI)، ایندهوین، هالنډ) په کارولو سره لیدل شوي چې په 200 kV (Lab6 ټرانسمیټر) کې کار کوي او د ګاتان CCD کیمره (ګاتان، انګلستان) چې د ټریډیم انرژي فلټر سره سمبال دی.
په هر تخنیکي نقل کې، لږترلږه ۲۴ واحد حجروي انځورونه ترلاسه شوي، چې ټولټال ۲۶۶ انځورونه وو. ټول انځورونه د علاقې د سیمې (ROI) میکرو او د مایټوکونډریا میکرو په کارولو سره تحلیل شوي. مایټوکونډریا میکرو د خپرو شویو میتودونو پر بنسټ والړ دی17,31,32 او په فیجي/ImageJ69 کې د TEM انځورونو نیمه اتوماتیک بیچ پروسس کولو ته اجازه ورکوي. په لنډه توګه: انځور د رولینګ بال شالید تخفیف (60 پکسل ریډیس) او د FFT بینډ پاس فلټر (په ترتیب سره د 60 او 8 پکسل پورتنۍ او ښکته حدودو په کارولو سره) او د 5٪ د اورینټیشن زغم سره عمودی لاین فشار په کارولو سره التهاب او التهاب شوی. پروسس شوی انځور په اتوماتيک ډول د اعظمي انټروپي الګوریتم په کارولو سره حد شوی او بائنری ماسک رامینځته کیږي. د خام TEM انځورونو کې د لاسي غوره شوي ROIs سره تړلي د انځور سیمې استخراج شوي، د مایټوکونډریا ځانګړتیا او د پلازما جھلی او نور لوړ برعکس سیمې پرته. د هر استخراج شوي ROI لپاره، د 600 پکسلونو څخه لوی بائنری ذرات تحلیل شوي، او د ذراتو ساحه، محیط، لوی او کوچني محورونه، د فیریټ قطر، ګردوالی، او ګردوالی د فیجي/ImageJ د جوړ شوي اندازه کولو دندو په کارولو سره اندازه شوي. د میریل، فلیپو، او سټریک (2017) تعقیب، ساحه 2، د ذراتو اړخ تناسب (د کوچني محور څخه لوی تناسب)، او د شکل فکتور (FF) د دې معلوماتو څخه محاسبه شوي، چیرې چې FF = محیط 2/4pi x ساحه. د پیرامیټریک فورمول تعریف په میریل، فلیپو، او سټریک (2017) کې موندل کیدی شي. ذکر شوي میکرو په ګیټ هب کې شتون لري (د معلوماتو شتون بیان وګورئ). په اوسط ډول، د PPA درملنې په هر وخت کې نږدې 5,600 ذرات تحلیل شوي، د ټولټال نږدې 17,000 ذراتو لپاره (معلومات نه ښودل شوي).
د SH-SH5Y حجرې په 8-چیمبر کلتوري لوښو کې ځای پر ځای شوې وې (ترمو فشر، #155411) ترڅو د شپې چپکولو ته اجازه ورکړي او بیا د TMRE 1:1000 (ترمو فشر، #T669) او هوچسټ 33342 1:200 (سیګما-الډریچ، H6024) سره انکیوبیټ شي. رنګ ورکول. انځورونه د 10 دقیقو چاپیریال کې د 405 nm او 561 nm لیزرونو په کارولو سره ترلاسه شوي، او خام انځورونه د z-سټیکس په توګه ترلاسه شوي چې د 10 عکس مایکروګرافونه لري چې د 0.2 μm د az ګام سره د عکس چوکاټونو ترمنځ په 12 راتلونکو وختونو کې. انځورونه د کارل زائس LSM780 ELYRA PS.1 سوپر ریزولوشن پلیټ فارم (کارل زائس، اوبرکوچن، جرمني) په کارولو سره د LCI پلان اپوکرومیټ 100x/1.4 تیلو DIC M27 لینز په کارولو سره راټول شوي. انځورونه په ImageJ کې د مخکې تشریح شوي پایپ لاین او ImageJ پلگ ان په کارولو سره تحلیل شوي ترڅو د فیوژن او فیژن پیښو، د مایټوکونډریال جوړښتونو اوسط شمیر، او د هر حجرې اوسط مایټوکونډریال حجم اندازه کړي 33. MEL میکرو په GitHub کې شتون لري (د معلوماتو شتون بیان وګورئ).
د SH-SY5Y حجرات د درملنې دمخه د 24 ساعتونو لپاره په شپږو څاه پلیټونو کې د 0.3 × 106 حجرو / ملی لیتر کثافت سره وده شوي. RNA د Quick-RNA™ Miniprep پروتوکول (ZR R1055، Zymo Research) په کارولو سره د لږ بدلونونو سره استخراج شو: د لرې کولو دمخه هرې څاه ته 300 μl RNA لیسیز بفر اضافه کړئ او هر نمونه د 30 μl DNase/RNase ایلیوشن سره د وروستي ګام په توګه لایس کړئ. - وړیا اوبه. ټولې نمونې د نانو ډراپ ND-1000 UV-Vis سپیکٹروفوټومیټر په کارولو سره د مقدار او کیفیت لپاره معاینه شوې. د حجرو لیسیټ څخه ټول پروټین د 200 μl RIPA لیسیز بفر په کارولو سره ترلاسه شو، او د پروټین غلظت د براډفورډ پروټین اسای 70 په کارولو سره اندازه شو.
د cDNA ترکیب د Tetro™ cDNA ترکیب کټ (BIO-65043، Meridian Bioscience) په کارولو سره د جوړونکي د لارښوونو سره سم د ځینو تعدیلاتو سره ترسره شو. cDNA د 20-μl تعاملاتو کې د ټول RNA 0.7 څخه تر 1 μg پورې ترکیب شو. پرائمرونه د پخوانیو خپرو شویو مقالو 42، 71، 72، 73، 74، 75، 76، 77، 78 (جدول S1) څخه غوره شوي او ورسره مل پروبونه د انټیګریټډ DNA ټیکنالوژیو څخه د پرائمر کویسټ وسیلې په کارولو سره ډیزاین شوي. د علاقې ټول جینونه د اټومي B2M جین ته نورمال شوي. د STOML2، NRF1، NFE2L2، TFAM، cMYC او OPA1 د جین څرګندونه د RT-qPCR لخوا اندازه شوې. په ماسټر مخلوط کې د LUNA Taq پولیمریز (M3003L، نیو انګلینډ بایولابز)، 10 μM فارورډ او ریورس پرائمرز، cDNA، او د PCR درجې اوبه شاملې وې ترڅو د هر غبرګون لپاره د 10 μL وروستی حجم تولید کړي. د ویش او فیژن جینونو څرګندونه (DRP1، MFN1/2) د TaqMan ملټي پلیکس ازمونو په کارولو سره اندازه شوه. د لونا یونیورسل پروب qPCR ماسټر مکس (M3004S، نیو انګلینډ بایولابز) د جوړونکي لارښوونو سره سم د کوچنیو بدلونونو سره کارول شوی و. د ملټي پلیکس RT-qPCR ماسټر مخلوط کې 1X LUNA Taq پولیمریز، 10 μM فارورډ او ریورس پرائمرز، 10 μM پروب، cDNA، او د PCR درجې اوبه شاملې دي، چې په پایله کې د هر غبرګون لپاره د 20 μL وروستی حجم رامینځته کیږي. RT-qPCR د روټر-جین Q 6-پلیکس (QIAGEN RG—سیریل شمیره: R0618110) په کارولو سره ترسره شو. د سایکل چلولو شرایط په جدول S1 کې ښودل شوي. د cDNA ټولې نمونې په درې ګوني ډول پراخه شوې او د لسو ګوني حلونو د لړۍ په کارولو سره یو معیاري منحنی رامینځته شو. د درې ګوني نمونو کې بهرني برخې چې د دورې حد معیاري انحراف (Ct) >0.5 سره وې د تحلیل څخه لرې شوې ترڅو د معلوماتو د تکثیر وړتیا ډاډمنه شي30,72. د نسبي جین څرګندونه د 2-ΔΔCt79 میتود په کارولو سره محاسبه شوه.
د پروټین نمونې (60 μg) د 2:1 تناسب سره د لایملي بارولو بفر سره مخلوط شوې او د 12٪ بې رنګ پروټین جیل (Bio-Rad #1610184) باندې چلول شوې. پروټینونه د ټرانس-بلاټ ټربو سیسټم (#170-4155، Bio-Rad) په کارولو سره د PVDF (پولی وینیلایډین فلورایډ) جھلی (#170-84156، Bio-Rad) ته لیږدول شوي. جھلی د 48 ساعتونو لپاره د مناسب لومړني انټي باډیز (OPA1، MFN1، MFN2، او DRP1) (1:1000 کم شوی) سره بند او انکیوبیټ شوی و، وروسته د 1 ساعت لپاره د ثانوي انټي باډیز (1:10,000) سره انکیوبیټ شوی و. بیا غشاګانې د کلیرټي ویسټرن ECL سبسټریټ (#170-5061، Bio-Rad) په کارولو سره انځور شوي او د Bio-Rad ChemiDoc MP سیسټم په کارولو سره ثبت شوي. د امیج لیب نسخه ۶.۱ د لویدیځ بلاټ تحلیل لپاره کارول شوې وه. اصلي جیل او بلاټ په شکل S1 کې ښودل شوي دي. د انټي باډي معلومات په جدول S2 کې چمتو شوي دي.
د معلوماتو سیټونه د لږترلږه دریو خپلواکو نمونو د اوسط (SEM) د اوسط او معیاري غلطۍ په توګه وړاندې کیږي. د معلوماتو سیټونه د شاپیرو-ویلکس ازموینې په کارولو سره د نورمالیت لپاره ازمول شوي (پرته لدې چې بل ډول وویل شي) مخکې لدې چې د ګاوسین ویش او مساوي معیاري انحرافاتو فرض کړي او تحلیلونو سره پرمخ لاړ شي. د فشر د MEL LSD (p < 0.05)، یو طرفه ANOVA (درملنه د کنټرول اوسط په مقابل کې)، او د ډنیټ د څو پرتله کولو ازموینې په کارولو سره د اهمیت ټاکلو لپاره د معلوماتو سیټ تحلیل کولو سربیره (p < 0.05). د پام وړ p ارزښتونه په ګراف کې د *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001 په توګه ښودل شوي. ټول احصایوي تحلیلونه او ګرافونه د ګراف پیډ پریزم 9.4.0 په کارولو سره ترسره شوي او تولید شوي.
د TEM انځور تحلیل لپاره د فیجي/ImageJ میکرو په عامه توګه په ګیټ هب کې شتون لري: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. د مایټوکونډریال ایونټ لوکیټر (MEL) میکرو په عامه توګه په ګیټ هب کې شتون لري: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
میلیانا اې.، دیوي این ایم او ویجیا اې. میتوکونډریا: د میټابولیزم، هوموستاسیس، فشار، عمر او ایپی جینیټکس ماسټر تنظیم کونکي. انډونیزیایي. بایومیډیکل ساینس. جي. ۱۳، ۲۲۱-۲۴۱ (۲۰۲۱).
بین-شاچار، ډي. په شیزوفرینیا کې څو اړخیزه مایټوکونډریال اختلال، پیچلی I د احتمالي رنځپوهنیز هدف په توګه. شیزوفرینیا. سرچینه. ۱۸۷، ۳-۱۰ (۲۰۱۷).
بوس، اې او بیل، د پارکنسن په ناروغۍ کې د مایټوکونډریال اختلال. جي. نیورو کیمیا. ۱۳۹، ۲۱۶-۲۳۱ (۲۰۱۶).
شرما وي کې، سنګ ټي جي او مهتا وي. فشار لرونکی مایټوکونډریا: د الزایمر ناروغۍ کې د یرغل هدفونه. مایټوکونډریا 59، 48-57 (2021).
بیلینګور پي.، ډوارټ جي ایم این، شوک پي ایف او فریرا جي کې مایټوکونډریا او دماغ: بایو انرجیټکس او نور ډیر څه. نیوروټوکسین. سرچینه. ۳۶، ۲۱۹-۲۳۸ (۲۰۱۹).
رنګاراجو، وي. او نور. پلیوټروپیک مایټوکونډریا: د نیورونال پراختیا او ناروغۍ باندې د مایټوکونډریا اغیز. جي. نیورو ساینس. ۳۹، ۸۲۰۰-۸۲۰۸ (۲۰۱۹).
کارډانو-راموس، سي. او موریس، VA په نیورونونو کې د مایټوکونډریال بایوجینیسیس: څنګه او چیرته. نړیوالتوب. جي. مور. ساینس. ۲۲، ۱۳۰۵۹ (۲۰۲۱).
یو، آر، لینډال، یو، نیسټر، ایم او ژاو، جي. د تی لرونکو مایټوکونډریال متحرکاتو تنظیم: فرصتونه او ننګونې. مخکینۍ برخه. انډروکرین. (لوزان) ۱۱، ۳۷۴ (۲۰۲۰).
خاچو، ایم. او سلیک، آر ایس د نیوروجینیسیس په تنظیم کې د مایټوکونډریال متحرکات: د ودې څخه تر بالغ دماغ پورې. پراختیا. متحرک. 247، 47-53 (2018).