اوسنی *اوسنی پته: کولون ۵۰۹۳۱، جرمني، کولون د عمر پورې اړوند ناروغیو کې د حجروي فشار غبرګون په اړه د ایکسیلینس کلسټر څیړنه (CECAD).
د مایټوکونډریال ناروغیو عصبي تخریب د نه بدلیدونکي په توګه ګڼل کیږي ځکه چې د نیورونونو میټابولیک پلاستیکیت محدود دی، مګر د بدن د نیورونال میټابولیزم د حجرو په خپلواکي باندې د مایټوکونډریال اختلال اغیز په ښه توګه نه پوهیږي. دلته، موږ د پورکینجي نیورونونو د حجرو ځانګړي پروټوم معرفي کوو چې د مایټوکونډریال فیوژن متحرکاتو ګډوډیدو له امله رامینځته شوي پرمختللي OXPHOS کمښت سره. موږ وموندله چې د مایټوکونډریال اختلال د پروټومیکونو په ساحه کې ژور بدلون رامینځته کړ، کوم چې په نهایت کې د حجرو د مړینې دمخه د دقیق میټابولیک برنامو ترتیب فعالولو لامل شو. په ناڅاپي ډول، موږ د پیروویټ کاربوکسیلیز (PCx) او نورو عمر ضد انزایمونو څرګند انډکشن مشخص کړ چې د TCA دورې منځګړیتوبونه بشپړوي. د PCx مخنیوی اکسیډیټیو فشار او نیوروډیجنریشن نور هم زیات کړ، دا په ګوته کوي چې ایتروسکلروسیس د OXPHOS نشتوالي نیورونونو کې محافظتي اغیزه لري. په لنډمهاله توګه تخریب شوي نیورونونو کې د مایټوکونډریال فیوژن بیا رغونه په بشپړ ډول دا میټابولیک ځانګړتیاوې بیرته راګرځوي، په دې توګه د حجرو د مړینې مخه نیسي. زموږ موندنې پخوانۍ نامعلومې لارې پیژني چې د مایټوکونډریال اختلال ته انعطاف ورکوي او ښیې چې عصبي تخریب حتی د ناروغۍ په وروستیو مرحلو کې بیرته راګرځیدلی شي.
د نیورونال انرژي میتابولیزم ساتلو کې د مایټوکونډریا مرکزي رول د انسان د مایټوکونډریا ناروغیو سره تړلو پراخو عصبي نښو لخوا ټینګار شوی. ډیری دا ناروغۍ د جین بدلونونو له امله رامینځته کیږي چې د مایټوکونډریا جین څرګندونه تنظیموي (1، 2) یا د مایټوکونډریا متحرکاتو پورې اړوند د جین ویجاړول، کوم چې په غیر مستقیم ډول د مایټوکونډریا DNA (mtDNA) ثبات اغیزه کوي (3، 4). د څارویو ماډلونو کې کار ښودلې چې د شاوخوا نسجونو کې د مایټوکونډریا اختلال په ځواب کې، محافظه کار میټابولیک لارې (5-7) فعال کیدی شي، کوم چې د دې پیچلو ناروغیو د رنځپوهنې ژورې پوهیدو لپاره مهم معلومات چمتو کوي. په بشپړ برعکس، د دماغ د مایټوکونډریا اډینوسین ټرای فاسفیټ (ATP) تولید عمومي ناکامۍ له امله رامینځته شوي د ځانګړو حجرو ډولونو میټابولیک بدلونونو په اړه زموږ پوهه بنسټیز ده (8)، د درملنې اهدافو پیژندلو اړتیا باندې ټینګار کوي چې د ناروغۍ مخنیوي یا مخنیوي لپاره کارول کیدی شي. د نیوروډیجنریشن مخه ونیسئ (9). د معلوماتو نشتوالی دا حقیقت دی چې عصبي حجرې په پراخه کچه د شاوخوا نسجونو د حجرو ډولونو په پرتله خورا محدود میټابولیک انعطاف لري (10). څرنګه چې دا حجرات د سیناپټیک لیږد د ودې او د ټپونو او ناروغیو شرایطو ته د ځواب ویلو لپاره نیورونونو ته د میټابولایټونو رسولو همغږي کولو کې مرکزي رول لوبوي، د دماغ نسجونو ننګونکو شرایطو سره د حجرو میټابولیزم د تطبیق وړتیا تقریبا د ګلیال حجرو پورې محدوده ده (11-14). سربیره پردې، د دماغ نسجونو ذاتي حجروي توپیر په لویه کچه د میټابولیک بدلونونو مطالعې مخه نیسي چې په ځانګړو نیورونال فرعي ګروپونو کې پیښیږي. په پایله کې، په نیورونونو کې د مایټوکونډریال اختلال د دقیق سیلولر او میټابولیک پایلو په اړه لږ څه پیژندل شوي.
د مایټوکونډریال اختلال د میټابولیک پایلو د پوهیدو لپاره، موږ د پورکینجي نیورونونه (PNs) د نیوروډیجنریشن په مختلفو مرحلو کې جلا کړل چې د مایټوکونډریال بهرنۍ غشا فیوژن (Mfn2) له منځه تللو له امله رامینځته کیږي. که څه هم په انسانانو کې د Mfn2 بدلونونه د میراثي موټرو حسي نیوروپیتي سره تړاو لري چې د چارکوټ-ماري-توت ډول 2A (15) په نوم پیژندل کیږي، په موږکانو کې د Mfn2 مشروط ویجاړول د اکسیډیشن فاسفوریلیشن (OXPHOS) اختلال میتود یو ښه پیژندل شوی انډکشن دی. د نیورون مختلف فرعي ډولونه (16-19) او پایله لرونکي نیوروډیجنریټي فینوټایپ د پرمختللو عصبي نښو سره مل دي، لکه د حرکت اختلالات (18، 19) یا سیریبیلر اټکسیا (16). د لیبل فری کمیتي (LFQ) پروټومیکونو، میټابولومیکونو، امیجنگ، او ویروولوژیکي میتودونو ترکیب په کارولو سره، موږ ښیو چې پرمختللی نیوروډیجنریشن په کلکه د پیروویټ کاربوکسیلاز (PCx) او نورو فکتورونو هڅونه کوي چې د PNs د شریانونو سکلیروسیس کې ښکیل دي د انزایمونو څرګندونه. د دې موندنې د تړاو تصدیق کولو لپاره، موږ په ځانګړي ډول د Mfn2 کمښت لرونکي PNs کې د PCx څرګندونه کمه کړه، او وموندله چې دا عملیات اکسیډیټیو فشار زیاتوي او د نیوروډیجنریشن ګړندی کوي، پدې توګه ثابتوي چې ازوسپرمیا د حجرو مرګ میټابولیک تطبیق ورکوي. د MFN2 شدید څرګندونه کولی شي د شدید OXPHOS کمښت، د مایټوکونډریال DNA لوی مصرف، او ظاهرا مات شوي مایټوکونډریال شبکې سره د ټرمینل تخریب PN په بشپړ ډول وژغوري، کوم چې نور ټینګار کوي چې د نیوروډیجنریشن دا بڼه حتی د حجرو مړینې دمخه د ناروغۍ په پرمختللي مرحله کې بیرته راګرځیدلی شي.
د Mfn2 ناک آوټ PNs کې د مایټوکونډریا د لیدلو لپاره، موږ د موږک یو فشار وکاروو چې Cre پورې تړلي مایټوکونډریا ته اجازه ورکوي چې ژیړ فلوروسینټ پروټین (YFP) (mtYFP) (20) Cre څرګندونه په نښه کړي او په ویوو کې د مایټوکونډریا مورفولوژي معاینه کړه. موږ وموندله چې په PNs کې د Mfn2 جین ویجاړول به د مایټوکونډریا شبکې تدریجي ویش لامل شي (شکل S1A)، او لومړنی بدلون د 3 اونیو په عمر کې وموندل شو. برعکس، د PN حجرو طبقې د پام وړ تخریب، لکه څنګه چې د Calbindin معافیت له لاسه ورکولو لخوا ثبوت شوی، د 12 اونیو عمر پورې پیل نه شو (شکل 1، A او B). د مایټوکونډریا مورفولوژي کې د لومړنیو بدلونونو او د نیورونال مړینې د لیدلو وړ پیل ترمنځ د وخت نا مطابقت موږ دې ته وهڅول چې د حجرو مړینې دمخه د مایټوکونډریا اختلال لخوا رامینځته شوي میټابولیک بدلونونه وڅیړو. موږ د فلوروسینس فعال شوي حجرو ترتیب کولو (FACS) پر بنسټ ستراتیژي رامینځته کړه ترڅو د YFP (YFP+) څرګندونکي PN (شکل 1C) جلا کړو، او په کنټرول موږکانو کې (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre)، چې وروسته د CTRL (شکل S1B) په نوم یادیږي. د YFP سیګنال د نسبي شدت پراساس د ګیټینګ ستراتیژۍ اصلاح کول موږ ته اجازه راکوي چې د PNs YFP+ بدن (YFPhigh) د غیر PNs (YFPneg) (شکل S1B) یا پوټیټیو فلوروسینټ اکسون/ډینډریټیک ټوټو (YFPlow؛ شکل S1D، کیڼ) څخه پاک کړو، چې د کنفوکل مایکروسکوپ لخوا تایید شوی (شکل S1D، ښي خوا). د طبقه بندي شوي نفوس د هویت تاییدولو لپاره، موږ د LFQ پروټومکس او بیا د اصلي اجزاو تحلیل ترسره کړ، او وموندله چې د YFPhigh او YFPneg حجرو (شکل S1C) ترمنځ روښانه جلاوالی شتون لري. د YFP لوړ حجرو د پیژندل شویو PNs نښه کونکو خالص غني کول ښودلي (د بیلګې په توګه Calb1، Pcp2، Grid2 او Itpr3) (21، 22)، مګر د پروټینونو هیڅ غني کول چې معمولا په نیورونونو یا نورو حجرو ډولونو کې څرګندیږي (شکل 1D)). په خپلواکو تجربو کې راټول شوي د YFP لوړ حجرو کې د طبقه بندي شوي نمونو ترمنځ پرتله کول د ارتباط ضخامت> 0.9 ښودلی، چې د بیولوژیکي نقلونو ترمنځ ښه تکثیر ښیې (شکل S1E). په لنډه توګه، دې معلوماتو د ممکنه PN د حاد او ځانګړي جلا کولو لپاره زموږ پلان تایید کړ. ځکه چې کارول شوی L7-cre ډرایور سیسټم د زیږون وروسته په لومړۍ اونۍ کې د موزیک بیا ترکیب هڅوي (23)، موږ د CTRL څخه موږکان راټولول پیل کړل او مشروط (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) نیورونونه راټول کړل. د بیا ترکیب بشپړیدو وروسته، دا د 4 اونیو په عمر کې Mfn2cKO بلل کیږي. د پای ټکي په توګه، موږ د 8 اونیو عمر غوره کړ کله چې د PN طبقه د څرګند مایټوکونډریال ټوټې کیدو سره سره سمه وه (شکل 1B او شکل S1A). په ټولیز ډول، موږ د 3013 پروټینونو اندازه وکړه، چې شاوخوا 22٪ یې د میتو کارټا 2.0 تشریحاتو پراساس وو چې د مایټوکونډریال پروټوم په توګه د مایټوکونډریال (شکل 1E) (شکل 1E) (24) پر بنسټ وو. د 8 اونۍ کې ترسره شوي د توپیر جین څرګندولو تحلیل وښودله چې د ټولو پروټینونو یوازې 10.5٪ د پام وړ بدلونونه درلودل (شکل 1F او شکل S1F)، چې له هغې څخه 195 پروټینونه ښکته تنظیم شوي او 120 پروټینونه پورته تنظیم شوي (شکل 1F). دا د یادونې وړ ده چې د دې ډیټا سیټ "نوښتګر لارې تحلیل" ښیې چې توپیر لرونکي څرګند شوي جینونه په عمده توګه د ځانګړي میټابولیک لارو محدود سیټ پورې اړه لري (شکل 1G). په زړه پورې خبره دا ده چې که څه هم د OXPHOS او کلسیم سیګنالینګ پورې اړوند د لارو کموالی د فیوژن کمښت لرونکي PNs کې د مایټوکونډریال اختلال هڅونه تاییدوي، نورې کټګورۍ چې په عمده توګه د امینو اسید میتابولیزم سره تړاو لري د پام وړ لوړ شوي، کوم چې د میټابولیزم سره سمون لري چې په مایټوکونډریال PNs کې واقع کیږي. بیا رغونه دوامداره ده.
(الف) د CTRL او Mfn2cKO موږکانو د دماغي برخو استازي کنفوکل عکسونه چې د PNs تدریجي ضایع ښیې (کالبینډین، خړ)؛ نیوکلی د DAPI سره مقابله شوي. (ب) د (الف) اندازه کول (د تغیر یو طرفه تحلیل، ***P<0.001؛ n = د دریو موږکانو څخه 4 څخه تر 6 حلقو پورې). (ج) تجربوي کاري جریان. (د) د پورکینجي (پورته) او نورو حجرو ډولونو (منځني) لپاره ځانګړي مارکرونو د تودوخې نقشه ویش. (ه) د وین ډیاګرام چې په طبقه بندي شوي PN کې د پیژندل شوي مایټوکونډریال پروټینونو شمیر ښیې. (ف) په 8 اونیو کې په Mfn2cKO نیورونونو کې د توپیر لرونکي څرګند شوي پروټینونو د آتش فشان پلاټ (د 1.3 د اهمیت کټ آف ارزښت). (ج) د تخلیقي لارې تحلیل په Mfn2cKO PN کې پنځه خورا مهم پورته تنظیم (سور) او ښکته تنظیم (نیلي) لارې ښیې چې د 8 اونیو په توګه طبقه بندي شوي. د هر کشف شوي پروټین اوسط څرګندونه کچه ښودل شوې. د تودوخې خړ پیمانه نقشه: د P ارزښت تنظیم شوی. ns، مهم نه دی.
د پروټومکس معلوماتو ښودلې چې د کمپلیکس I، III، او IV پروټین څرګندونه په تدریجي ډول کمه شوې. کمپلیکس I، III، او IV ټولو اړین mtDNA- کوډ شوي فرعي واحدونه درلودل، پداسې حال کې چې پیچلي II، چې یوازې اټومي کوډ شوی و، په اصل کې غیر اغیزمن و (شکل 2A او شکل S2A). . د پروټومکس پایلو سره سم، د سیریبیلر نسج برخو معافیتي کیمیا ښودلې چې په PN کې د پیچلي IV د MTCO1 (مایټوکونډریال سایټوکروم C اکسیډیز سب یونټ 1) فرعي واحد کچه په تدریجي ډول کمه شوې (شکل 2B). د mtDNA- کوډ شوي فرعي واحد Mtatp8 د پام وړ کم شوی (شکل S2A)، پداسې حال کې چې د اټومي کوډ شوي ATP ترکیب شوي فرعي واحد د ثابت حالت کچه ​​بدله پاتې شوه، کوم چې د پیژندل شوي مستحکم ATP ترکیب شوي فرعي واحد F1 کمپلیکس سره مطابقت لري کله چې د mtDNA څرګندونه مستحکم وي. جوړښت ثابت دی. مداخله (7). د ریښتیني وخت پولیمیریز چین عکس العمل (qPCR) لخوا په ترتیب شوي Mfn2cKO PNs کې د mtDNA کچې ارزونې د mtDNA کاپي شمیر کې تدریجي کمښت تایید کړ. د کنټرول ګروپ سره پرتله کول، د 8 اونیو په عمر کې، د mtDNA کچه یوازې شاوخوا 20٪ ساتل شوې وه (شکل 2C). د دې پایلو سره سم، د Mfn2cKO PNs کنفوکل مایکروسکوپي سټینینګ د DNA کشف کولو لپاره کارول شوی و، چې د مایټوکونډریل نیوکلیوټایډونو وخت پورې تړلي مصرف ښیې (شکل 2D). موږ وموندله چې یوازې ځینې نوماندان چې د مایټوکونډریل پروټین تخریب او فشار غبرګون کې ښکیل وو تنظیم شوي وو، پشمول د Lonp1، Afg3l2 او Clpx، او OXPHOS پیچلي اسمبلۍ فکتورونه. د اپوپټوسس کې ښکیل پروټینونو په کچه کې کوم د پام وړ بدلون نه دی موندل شوی (شکل S2B). په ورته ډول، موږ وموندله چې د کلسیم ټرانسپورټ کې ښکیل مایټوکونډریا او انډوپلاسمیک ریټیکولم چینلونه یوازې کوچني بدلونونه لري (شکل S2C). برسېره پردې، د آټوفیجي پورې اړوند پروټینونو ارزونې هیڅ د پام وړ بدلونونه ونه موندل، کوم چې د امیونوهیسټو کیمیا او الکترون مایکروسکوپي لخوا په ویوو کې لیدل شوي د آټوفاګوزومونو د لید انډکشن سره مطابقت لري (شکل S3). په هرصورت، په PNs کې د OXPHOS پرمختللی اختلال د څرګند الټراسټرکچرل مایټوکونډریال بدلونونو سره مل دی. د مایټوکونډریال کلسترونه د Mfn2cKO PNs د حجرو په بدنونو او ډینډریټیک ونو کې لیدل کیدی شي چې 5 او 8 اونۍ عمر لري، او د داخلي غشا جوړښت ژور بدلونونه راوړي (شکل S4، A او B). د دې الټراسټرکچرل بدلونونو او په mtDNA کې د پام وړ کمښت سره سم، د ټیترامیتیلروډامین میتیل ایسټر (TMRM) سره د حاد دماغي سیریبیلر سلائسونو تحلیل ښودلې چې په Mfn2cKO PNs کې د مایټوکونډریال غشا ظرفیت د پام وړ کم شوی (شکل S4C).
(الف) د OXPHOS کمپلیکس د څرګندولو کچې د وخت کورس تحلیل. یوازې په 8 اونیو کې د P<0.05 سره پروټینونه په پام کې ونیسئ (دوه اړخیزه ANOVA). نقطه لرونکی کرښه: د CTRL په پرتله هیڅ سمون نشته. (ب) کیڼ اړخ: د MTCO1 ضد انټي باډي سره لیبل شوي د سیریبیلر برخې یوه بیلګه (د پیمانه بار، 20 μm). د پورکینجي حجرو بدنونو لخوا نیول شوې ساحه د ژیړ رنګ سره پوښل شوې ده. ښي اړخ: د MTCO1 کچو اندازه کول (د تغیر یو طرفه تحلیل؛ n = له 7 څخه تر 20 حجرو پورې د دریو موږکانو څخه تحلیل شوي). (ج) په ترتیب شوي PN کې د mtDNA کاپي شمیرې qPCR تحلیل (د تغیر یو طرفه تحلیل؛ n = له 3 څخه تر 7 موږکانو پورې). (د) کیڼ اړخ: د سیریبیلر ټوټې یوه بیلګه چې د DNA ضد انټي باډي سره لیبل شوې (د پیمانه بار، 20 μm). د پورکینجي حجرو بدنونو لخوا نیول شوې ساحه د ژیړ رنګ سره پوښل شوې ده. ښي اړخ: د mtDNA زخمونو اندازه کول (د تغیر یو طرفه تحلیل؛ n = له 5 څخه تر 9 حجرو پورې د دریو موږکانو څخه). (E) د حاد سیریبیلر برخې یوه بیلګه چې د بشپړ حجرو پیچ کلیمپ ثبتولو کې د mitoYFP + پورکینجي حجرو (تیر) ښیې. (F) د IV منحني اندازه کول. (G) په CTRL او Mfn2cKO پورکینجي حجرو کې د ډیپولاریز کولو اوسني انجیکشن نماینده ګي ثبت کول. پورتنۍ ټریس: لومړی نبض چې AP یې پیل کړ. ښکته ټریس: اعظمي AP فریکونسي. (H) د پوسټ سیناپټیک ناڅاپي ان پټونو (sPSPs) اندازه کول. د نماینده ثبت کولو ټریس او د هغې زوم تناسب په (I) کې ښودل شوي. د تغیر یو طرفه تحلیل د دریو موږکانو څخه n = 5 څخه تر 20 حجرو تحلیل شوی. معلومات د اوسط ± SEM په توګه څرګند شوي؛ *P <0.05؛ **P <0.01؛ ***P <0.001. (J) د سوري شوي پیچ کلیمپ حالت په کارولو سره ثبت شوي د ناڅاپي AP نماینده ګي نښې. پورتنۍ ټریس: اعظمي AP فریکونسي. لاندې ټریس: د یو واحد AP زوم. (K) د (J) مطابق د اوسط او اعظمي AP فریکونسي اندازه کول. د مان-ویټني ازموینه؛ n = 5 حجرې د څلورو موږکانو څخه تحلیل شوي. معلومات د اوسط ± SEM په توګه ښودل شوي؛ مهم ندي.
د OXPHOS څرګند زیان په 8 اونیو عمر لرونکي Mfn2cKO PN کې وموندل شو، چې دا په ګوته کوي چې د نیورونونو فزیولوژیکي فعالیت په جدي ډول غیر معمولي دی. له همدې امله، موږ د 4 څخه تر 5 اونیو او 7 څخه تر 8 اونیو کې د OXPHOS کمښت لرونکي نیورونونو غیر فعال بریښنایی ځانګړتیاوې د حاد سیریبیلر سلائسونو کې د بشپړ حجرو پیچ کلیمپ ثبت کولو سره تحلیل کړې (شکل 2E). په ناڅاپي ډول، د Mfn2cKO نیورونونو اوسط آرام غشا ظرفیت او د ننوتلو مقاومت کنټرول ته ورته و، که څه هم د حجرو ترمنځ فرعي توپیرونه شتون درلود (جدول 1). په ورته ډول، د 4 څخه تر 5 اونیو عمر کې، د اوسني ولټاژ اړیکې (IV منحني) کې کوم مهم بدلون ونه موندل شو (شکل 2F). په هرصورت، د 7 څخه تر 8 اونیو عمر لرونکي هیڅ Mfn2cKO نیورون د IV رژیم (هایپرپولرائزیشن مرحله) څخه ژوندی پاتې نه شو، دا په ګوته کوي چې پدې وروستي مرحله کې د هایپرپولرائزیشن ظرفیت ته روښانه حساسیت شتون لري. په برعکس، په Mfn2cKO نیورونونو کې، هغه ډیپولاریزینګ جریانونه چې د تکراري عمل احتمالي (AP) خارجیدو لامل کیږي ښه زغمل کیږي، دا په ګوته کوي چې د دوی ټول خارجیدو نمونې د 8 اونیو زاړه کنټرول نیورونونو څخه د پام وړ توپیر نلري (جدول 1 او شکل 2G). په ورته ډول، د ناڅاپي پوسټ سیناپټیک جریانونو (sPSCs) فریکونسي او طول البلد د کنټرول ګروپ سره پرتله کیدونکی و، او د پیښو فریکونسي د 4 اونیو څخه 5 اونیو څخه 7 اونیو څخه 8 اونیو ته د ورته زیاتوالي سره لوړه شوه (شکل 2، H او I). په PNs کې د سیناپټیک پخیدو موده (25). ورته پایلې د سوراخ شوي PNs پیچونو وروسته ترلاسه شوې. دا ترتیب د حجروي ATP نیمګړتیاو احتمالي جبران مخه نیسي، لکه څنګه چې ممکن د ټول حجروي پیچ کلیمپ ثبتولو کې پیښ شي. په ځانګړي توګه، د Mfn2cKO نیورونونو د آرامۍ غشا ظرفیت او د ناڅاپي ډزو فریکونسي اغیزمنه نه شوه (شکل 2، J او K). په لنډه توګه، دا پایلې ښیي چې د OXPHOS د څرګند اختلال سره PNs کولی شي د لوړ فریکونسۍ خارجیدو نمونو سره ښه مقابله وکړي، دا په ګوته کوي چې د خسارې میکانیزم شتون لري چې دوی ته اجازه ورکوي چې نږدې نورمال الیکټرو فزیولوژیکي غبرګونونه وساتي.
معلومات د اوسط ± SEM په توګه څرګند شوي (د توپیر یو اړخیز تحلیل، د هولم-سیداک څو اړخیزه پرتله کولو ازموینه؛ *P<0.05). د واحد شمیره د قوسونو لخوا ښودل شوې.
موږ د دې لپاره پیل وکړ چې وڅیړو چې ایا د پروټومکس ډیټاسیټ (شکل 1G) کې کوم کټګورۍ هغه لارې لري چې کولی شي د شدید OXPHOS کمښت سره مبارزه وکړي، پدې توګه تشریح کوي چې ولې اغیزمن شوی PN کولی شي نږدې نورمال الیکټروفیزولوژي وساتي (شکل 2، E څخه K). د پروټومکس تحلیل ښودلې چې د شاخ شوي چین امینو اسیدونو (BCAA) کیټابولیزم کې ښکیل انزایمونه د پام وړ لوړ تنظیم شوي (شکل 3A او شکل S5A)، او وروستی محصول اسیتیل-CoA (CoA) یا سوسینیل CoA کولی شي د شریانونو سکلیروسیس اسید (TCA) دورې کې ټرای کاربوکسیلیټونه بشپړ کړي. موږ وموندله چې د BCAA ټرانسامینیز 1 (BCAT1) او BCAT2 مینځپانګه دواړه زیاته شوې. دوی د α-ketoglutarate (26) څخه د ګلوټامیټ تولیدولو سره د BCAA کیټابولیزم لومړی ګام کتلیز کوي. ټول فرعي واحدونه چې د شاخه شوي زنځیر کیټو اسید ډیهایډروجنیز (BCKD) کمپلیکس جوړوي لوړ تنظیم شوي دي (پیچلی د پایله شوي BCAA کاربن کنکال وروسته او نه بدلیدونکي ډیکاربوکسیلیشن کتلیز کوي) (شکل 3A او شکل S5A). په هرصورت، په ترتیب شوي PN کې پخپله BCAA کې هیڅ څرګند بدلون ونه موندل شو، کوم چې ممکن د دې اړینو امینو اسیدونو د حجرو د زیاتوالي یا د TCA دورې بشپړولو لپاره د نورو سرچینو (ګلوکوز یا لیکټیک اسید) کارولو له امله وي (شکل S5B). هغه PNs چې OXPHOS نلري د 8 اونیو په عمر کې د ګلوټامین تخریب او ټرانسامینیشن فعالیتونه هم ښیې، کوم چې د مایټوکونډریال انزایمونو ګلوټامینیز (GLS) او ګلوټامین پیروویټ ټرانسامینیز 2 (GPT2) د لوړ تنظیم لخوا منعکس کیدی شي (شکل 3، A او C). دا د یادونې وړ ده چې د GLS لوړ تنظیم د ویشل شوي ایزوفارم ګلوټامینیز C (GLS-GAC) پورې محدود دی (د Mfn2cKO/CTRL بدلون نږدې 4.5 ځله دی، P = 0.05)، او د سرطان نسجونو کې د هغې ځانګړي لوړ تنظیم کولی شي د مایټوکونډریال بایو انرژي ملاتړ وکړي. (27).
(الف) د تودوخې نقشه د 8 اونیو په موده کې د ټاکل شوي لارې لپاره د پروټین په کچه کې د فولډ بدلون ښیي. (ب) د انټي PCx انټي باډي سره لیبل شوي د سیریبیلر ټوټې مثال (پیمانه بار، 20 μm). ژیړ تیر د پورکینجي حجرو بدن ته اشاره کوي. (ج) د وخت کورس پروټین څرګندونې تحلیل د ایتروسکلروسیس لپاره د مهم نوماند په توګه پیژندل شوی (ډیری t-ټیسټ، *FDR <5٪؛ n = 3-5 موږکان). (د) پورته: یو سکیماتیک ډیاګرام چې د [1-13C] پیروویټ ټرسر کې شامل لیبل شوي کاربن ته د ننوتلو مختلفې لارې ښیې (د بیلګې په توګه، د PDH یا ټرانس-آرټیریل لارې له لارې). ښکته: د وایلن چارټ د واحد لیبل شوي کاربن (M1) سلنه ښیې چې د [1-13C] پیروویټ (جوړه t-ټیسټ؛ ** P <0.01) سره د حاد سیریبیلر ټوټې لیبل کولو وروسته اسپارټیک اسید، سیټریک اسید او مالیک اسید ته بدل شوي. (ه) د ښودل شوي لارې جامع وخت تاریخ تحلیل. یوازې هغه پروټینونه په پام کې ونیسئ چې P<0.05 لري په 8 اونیو کې. ډیش شوی کرښه: د سمون ارزښت نشته (د توپیر دوه اړخیز تحلیل؛ * P <0.05؛ *** P <0.001). معلومات د اوسط ± SEM په توګه څرګند شوي.
زموږ په تحلیل کې، BCAA کیټابولیزم د پورته تنظیم کولو یو له مهمو لارو څخه ګرځیدلی دی. دا حقیقت په کلکه وړاندیز کوي چې د TCA دورې ته د ننوتلو د هوا حجم ممکن د PN په نشتوالي کې د OXPHOS کې بدلون ومومي. دا ممکن د نیورونال میټابولیک بیا رغولو یوه لویه بڼه استازیتوب وکړي، کوم چې ممکن د شدید OXPHOS اختلال ساتلو پرمهال د نیورونال فیزیولوژي او بقا باندې مستقیم اغیزه ولري. د دې فرضیې سره سم، موږ وموندله چې اصلي ضد ایتروسکلروټیک انزایم PCx پورته تنظیم شوی (Mfn2cKO/CTRL نږدې 1.5 ځله بدلیږي؛ شکل 3A)، کوم چې د پیروویټ اکسالواسیټیټ ته بدلون کتلیز کوي (28)، کوم چې باور کیږي چې د دماغ نسج کې څرګندونه د اسټروسایټونو پورې محدوده ده (29، 30). د پروټومیکس پایلو سره سم، کنفوکل مایکروسکوپي وښودله چې د PCx څرګندونه په ځانګړي ډول او د پام وړ د OXPHOS کمښت لرونکي PNs کې زیاته شوې وه، پداسې حال کې چې د PCx عکس العمل په عمده توګه د کنټرول نږدې برګمن ګلیال حجرو پورې محدود و (شکل 3B). د PCx د مشاهده شوي لوړ تنظیم په فعاله توګه ازموینې لپاره، موږ د حاد سیریبیلر سلائسونو درملنه د [1-13C] پیروویټ ټرسر سره وکړه. کله چې پیروویټ د پیروویټ ډیهایډروجنیز (PDH) لخوا اکسیډیز شو، د هغې آاسوټوپ لیبل ورک شو، مګر د TCA دورې منځګړیو کې شامل شو کله چې پیروویټ د عصبي تعاملاتو لخوا میټابولیز کیږي (شکل 3D). زموږ د پروټومیکس معلوماتو په ملاتړ کې، موږ د Mfn2cKO سلائسونو په اسپارټیک اسید کې د دې ټرسر څخه د مارکرونو لوی شمیر ولیدل، پداسې حال کې چې سیټریک اسید او مالیک اسید هم یو معتدل رجحان درلود، که څه هم د پام وړ ندي (شکل 3D).
د میتو پارک موږکانو د ډوپامین نیورونونو کې چې د مایټوکونډریال اختلال سره مخ دي چې د ډوپامین نیورونونو له امله رامینځته کیږي چې په ځانګړي ډول د مایټوکونډریال ټرانسکرپشن فاکتور A جین (Tfam) له مینځه وړي (شکل S6B)، د PCx څرګندونه هم د پام وړ لوړ تنظیم شوې وه (31)، دا په ګوته کوي چې د اسیټون اسید ارټیروسکلروسیس د ناروغۍ پیښې په بدن کې د نیورونال OXPHOS د اختلال په جریان کې تنظیم کیږي. د یادونې وړ ده چې دا موندل شوي چې ځانګړي انزایمونه (32-34) چې ممکن په نیورونونو کې څرګند شي چې ممکن د ارټیروسکلروسیس سره تړاو ولري په PNs کې د پام وړ لوړ تنظیم شوي چې په OXPHOS کې شتون نلري، لکه پروپیونیل-CoA کاربوکسیلیز (PCC-A)، مالونیل-CoA پروپیونیل-CoA ته succinyl-CoA او مایټوکونډریال مالیک انزایم 3 (ME3) بدلوي، چې اصلي رول یې د مالټ څخه پیروویټ بیرته ترلاسه کول دي (شکل 3، A او C) (33، 35). سربیره پردې، موږ په Pdk3 انزایم کې د پام وړ زیاتوالی وموند، کوم چې فاسفوریلیټ کوي او په دې توګه PDH غیر فعالوي (36)، پداسې حال کې چې په Pdp1 انزایم کې هیڅ بدلون نه دی موندل شوی چې PDH یا د PDH انزایم کمپلیکس پخپله فعالوي (شکل 3A). په دوامداره توګه، په Mern2cKO PNs کې، په Ser293 کې د PDH کمپلیکس د پیروویټ ډیهایډروجنیز E1 برخې د α1 سبونیټ α (PDHE1α) فرعي یونټ فاسفوریلیشن (د PDH د انزایم فعالیت مخنیوي لپاره پیژندل شوی) لوړ شوی (شکل S6C) (شکل S6C). پیروویټ هیڅ رګونو ته لاسرسی نلري.
په پای کې، موږ وموندله چې د سیرین او ګلایسین بایوسینتیزس سوپر لاره، د اړونده مایټوکونډریال فولیټ (1C) دوره او پرولین بایوسینتیزس (شکل 1G او شکل S5C) ټول د راپورونو له مخې، د فعالولو پروسې په جریان کې د پام وړ لوړ تنظیم شوي دي. شاوخوا نسجونه د مایټوکونډریال اختلال (5-7) سره فعال شوي دي. د دې پروټومیک معلوماتو ملاتړ کونکي کنفوکال تحلیل ښیې چې په PN کې چې OXPHOS ورک دی، د 8 اونیو عمر لرونکو موږکانو سیریبیلر ټوټې د سیرین هایدروکسی میتیل ټرانسفیریز 2 (SHMT2) سره مخ شوي، چې د مایټوکونډریال فولیټ دورې یو مهم انزایم دی. د معافیت د پام وړ غبرګون (شکل S5D). په 13 CU-ګلوکوز-انکیوبیټ شوي حاد سیریبیلر ټوټو کې، د میټابولیک تعقیب تجربو د سیرین او پرولین بایوسینتیزس لوړ تنظیم نور هم تایید کړ، دا په ګوته کوي چې د کاربن اسوفارمونو جریان سیرین او پرولین ته زیات شوی (شکل S5E). څرنګه چې د GLS او GPT2 لخوا هڅول شوي تعاملات د ګلوټامین څخه د ګلوټامیټ ترکیب او د ګلوټامیټ او α-کیټوګلوټاریټ ترمنځ د لیږد مسؤلیت لري، د دوی لوړ تنظیم ښیي چې د OXPHOS کمښت لرونکي نیورونونه د ګلوټامیټ لپاره ډیر تقاضا لري، دا ممکن د پرولین د زیاتوالي بایوسینتیسس ساتلو لپاره وي (شکل S5C). د دې بدلونونو برعکس، د PN-ځانګړي Mfn2cKO موږکانو څخه د سیریبیلر اسټروسایټونو پروټومیک تحلیل وښودله چې دا لارې (د ټولو انټي پیرو آکسایډیزونو په شمول) په څرګندولو کې د پام وړ بدلون نه دی راغلی، پدې توګه دا ښیې چې دا میټابولیک ریډیریکشن د تخریب شوي PN لپاره انتخابي دی (شکل S6، D څخه G).
په لنډه توګه، دې تحلیلونو په PNs کې د ځانګړو میټابولیک لارو د وختي فعالولو د پام وړ مختلف نمونې څرګندې کړې. که څه هم غیر معمولي نیورونال مایټوکونډریال فعالیت کولی شي د لومړني ایتروسکلروسیس او 1C بیا رغولو لامل شي (شکل 3E او شکل S5C)، او حتی د I او IV کمپلیکسونو په څرګندولو کې د وړاندوینې وړ بدلونونه، د سیرین ډی نوو ترکیب کې بدلونونه یوازې دي دا یوازې په وروستیو مرحلو کې څرګند شو. د OXPHOS اختلال (شکل 3E او شکل S5C). دا موندنې یو ترتیبي پروسه تعریفوي چې پکې د فشار له امله رامینځته شوی مایټوکونډریال (1C دوره) او سایټوپلاسمیک (سیرین بایوسینتیسس) د TCA دوره کې د ایتروسکلروسیس زیاتوالي سره په همغږۍ سره غبرګون ښیې ترڅو نیورونال میټابولیزم بیا شکل ورکړي.
د 8 اونیو عمر لرونکي OXPHOS کمښت لرونکي PNs کولی شي د لوړې فریکونسۍ هڅونې فعالیت وساتي او د مایټوکونډریال اختلال لپاره د جبران لپاره د پام وړ میټابولیک بیا نښلولو څخه تیر شي. دا کشف یو په زړه پورې امکان رامینځته کوي چې حتی پدې شیبه کې، دا حجرې ممکن د نیوروډیجنریشن ځنډولو یا مخنیوي لپاره معالجوي مداخله هم ترلاسه کړي. ناوخته. موږ دا امکان د دوه خپلواکو مداخلو له لارې حل کړ. په لومړۍ طریقه کې، موږ د Cre-انحصار اډینو-اړیکو ویروس (AAV) ویکتور ډیزاین کړ ترڅو MFN2 په انتخابي ډول د OXPHOS کمښت لرونکي PNs in vivo کې څرګند شي (شکل S7A). د AAV کوډ کولو MFN2 او د فلوروسینټ راپور ورکوونکي جین mCherry (Mfn2-AAV) په ویټرو کې د لومړني نیورون کلتورونو کې تایید شوي، کوم چې د MFN2 لامل شوی چې په Cre-انحصار ډول څرګند شي او د مایټوکونډریال مورفولوژي وژغوري، په دې توګه په Mfn2cKO نیورونونو کې د نیورومیوټیشن مخه نیسي (شکل S7، B، D او E). بیا، موږ په ویوو کې تجربې ترسره کړې ترڅو په سټیریوټیک ډول د 8 اونیو عمر لرونکي Mfn2-AAV د Mfn2cKO او کنټرول موږکانو سیریبیلر کورټیکس ته ورسوي، او د 12 اونیو عمر لرونکي موږکانو تحلیل یې وکړ (شکل 4A). درملنه شوي Mfn2cKO موږکان مړه شول (شکل 1، A او B) (16). په ویوو کې د ویروس لیږد د ځینو سیریبیلر حلقو کې د PN انتخابي څرګندونه پایله درلوده (شکل S7، G او H). د کنټرول AAV انجیکشن چې یوازې mCherry (Ctrl-AAV) څرګندوي په Mfn2cKO څارویو کې د نیوروډیجنریشن درجې باندې د پام وړ اغیزه نه درلوده. برعکس، د Mfn2-AAV سره لیږدول شوي Mfn2cKOs تحلیل د PN حجرو طبقې (شکل 4، B او C) د پام وړ محافظتي اغیزه ښودلې. په ځانګړي توګه، د نیورون کثافت داسې ښکاري چې د کنټرول څارویو څخه تقریبا توپیر نلري (شکل 4، B او C، او شکل S7، H او I). د MFN1 څرګندونه مګر MFN2 نه د عصبي مرګ په ژغورلو کې په مساوي ډول اغیزمنه ده (شکل 4C او شکل S7، C او F)، کوم چې دا په ګوته کوي چې د ایکټوپیک MFN1 څرګندونه کولی شي په مؤثره توګه د MFN2 نشتوالی بشپړ کړي. د واحد PN په کچه نور تحلیل ښودلې چې Mfn2-AAV په لویه کچه د مایټوکونډریا الټراسټرکچر وژغوره، د mtDNA کچه یې نورمال کړه، او د انټي اینجیوجینیسیس مارکر PCx لوړ څرګندونه یې بیرته راګرځوله (شکل 4، C څخه E). د آرام حالت کې د ژغورل شوي Mfn2cKO موږکانو بصري تفتیش وښودله چې د دوی حالت او د موټرو نښې نښانې (حرکت S1 څخه S3 ته) ښه شوي. په پایله کې، دا تجربې ښیي چې د OXPHOS کې د شدید کمښت سره PNs ته د MFN2 ځنډول بیا معرفي کول د mtDNA مصرف بیرته راګرځولو او د ایتروسکلروسیس هڅولو لپاره کافي دي، په دې توګه د اکسون تخریب او په ویوو کې د نیورونال مړینې مخه نیسي.
(الف) یوه سکیم چې د AAV کوډ کولو MFN2 انجیکشن کولو لپاره د تجربوي مهالویش ښیې کله چې اشاره شوې میټابولیک لاره فعاله شي. (ب) د 12 اونیو زاړه سیریبیلر سلائسونو استازي کنفوکل انځورونه چې په 8 اونیو کې په Mfn2cKO موږکانو کې لیږدول شوي او د انټي کالبینډین انټي باډي سره لیبل شوي. ښي خوا ته: د ایکسن فایبرونو اندازه کول. د ایکسن زوم پیمانه 450 او 75 μm ده. (ج) کیڼ اړخ ته: د AAV لیږد لوپ (AAV+) کې د پورکینجي حجرو کثافت اندازه کول (د تغیر یو طرفه تحلیل؛ n = 3 موږکانو). ښي خوا ته: د 12 اونۍ کې په لیږد شوي PN کې د mtDNA تمرکز تحلیل (بې جوړې t-ټیسټ؛ n = 6 حجرې له دریو موږکانو څخه). * P <0.05؛ ** P <0.01. (د) د Mfn2cKO سیریبیلر برخو د PNs استازي لیږد الکترون مایکروګرافونه د ښودل شوي ویروس ویکتورونو سره لیږدول شوي. ګلابي ماسک د ډینډرایټونو لخوا نیول شوې ساحه ښیې، او ژیړ نقطه لرونکی مربع په ښي خوا کې چمتو شوی زوم ښیې؛ n د هستې استازیتوب کوي. د پیمانه بار، 1μm. (E) د 12 اونیو په اوږدو کې د لیږد شوي PN کې د PCx داغ کولو یوه بیلګه ښیې. د پیمانه بار، 20μm. OE، ډیر څرګندونه؛ FC، د فولډ بدلون.
په پای کې، موږ په هغو PNs کې د پیرو آکسیډیز هڅول شوي حجرو د بقا اهمیت وڅیړلو چې د OXPHOS اختلال تجربه کړی دی. موږ د mCherry کوډ کولو AAV-shRNA (لنډ ویښتان RNA) په ځانګړي ډول د موږک PCx mRNA (AAV-shPCx) په نښه کولو سره تولید کړ، او ویروس یا د هغې سکریبلډ کنټرول (AAV-scr) د Mfn2cKO موږکانو سیریبیلم ته داخل کړ. انجیکشن د عمر په څلورمه اونۍ کې ترسره شو (شکل 5A) ترڅو د PCx مؤثره ټکان ترلاسه کړي په هغه دوره کې کله چې د PCx څرګندونه زیاته شوه (شکل 3C) او د PN حجرو طبقه لاهم سمه وه (شکل 1A). دا د یادونې وړ ده چې د PCx ښکته کول (شکل S8A) د PN مړینې د پام وړ سرعت لامل کیږي، کوم چې د اخته شوي حلقې پورې محدود دی (شکل 5، B او C). د PCx د لوړ تنظیم له امله رامینځته شوي میټابولیک اغیزو میکانیزم پوهیدو لپاره، موږ د PCx ناک ډاون او AAV-منځګړیتوب آپټیکل بایوسینسر Grx1-roGFP2 وروسته د PNs ریډوکس حالت مطالعه کړ (شکل S8، B څخه D) د ګلوټاتیون ارزولو لپاره د پیپټایډ ریډوکس پوټینشیل نسبي بدلون (38). بیا، موږ د FLIM شرایطو تصدیق کولو وروسته د سایټوپلاسمیک ریډوکس حالت کې احتمالي بدلونونه کشف کولو لپاره د 7 اونیو زاړه Mfn2cKO یا کنټرول لیټرمیټونو په حاد دماغ سلائسونو کې دوه فوټون فلوروسینس ژوند امیجنگ مایکروسکوپي (FLIM) ترسره کړ (شکل S8، E څخه G). تحلیل د یو واحد Mfn2cKO PNs د اکسیډیشن حالت کې د پام وړ زیاتوالی ښودلی چې د PCx څرګندونه نلري، کوم چې د کنټرول نیورونونو یا Mfn2cKO PNs څخه توپیر لري چې یوازې سکریبل شوي shRNA څرګندوي (شکل 5، D او E). کله چې د PCx څرګندونه کمه تنظیم شوه، د Mfn2cKO PNs سلنه چې خورا اکسیډیز شوی حالت ښیې له درې ځله څخه ډیر زیات شو (شکل 5E)، دا په ګوته کوي چې د PCx لوړ تنظیم د تخریب شوي نیورونونو ریډوکس ظرفیت ساتلی.
(الف) یوه سکیم چې د AAV کوډ کولو shPCx انجیکشن کولو لپاره د تجربوي مهالویش ښیې کله چې اشاره شوې میټابولیک لاره فعاله شي. (ب) په Mfn2cKO موږکانو کې د 8 اونیو زاړه سیریبیلر برخو استازي کنفوکال عکسونه په 4 اونیو کې د انټي کیلسینورین انټي باډي سره لیږدول شوي او لیبل شوي. د پیمانه بار، 450μm. (ج) د AAV-ټرانسډ شوي لوپونو کې د پورکینجي حجرو کثافت اندازه کول (د تغیر یو طرفه تحلیل؛ n = 3 څخه تر 4 موږکانو). معلومات د اوسط ± SEM په توګه څرګند شوي؛ ***P <0.001. (د) د FLIM استازی انځور د 7 اونیو زاړه PN د ګلوټاتیون ریډوکس سینسر Grx1-roGFP2 څرګندولو اوسط ژوند موده ښیې چې د ټاکل شوي تجربوي شرایطو لاندې. LUT (د لید جدول) تناسب: د ژوندي پاتې کیدو وخت وقفه (په پیکوسیکنډونو کې). د پیمانه بار، 25μm. (E) هسټوګرام د Grx1-roGFP2 د ژوند ارزښتونو ویش د (D) څخه ښیي (n=158 څخه تر 368 حجرو پورې په دوه موږکانو کې د هر حالت لاندې). د هر هسټوګرام پورته پای چارټ: د حجرو شمیر ښیې چې د پام وړ اوږد (سور، اکسیډیز شوی) یا لنډ (نیلي، کم شوی) د ژوند ارزښتونه لري، کوم چې په CTRL-AAV-scr کې د اوسط ژوند ارزښت 1 SD څخه ډیر دي. (F) وړاندیز شوی ماډل د نیورونال PCx د لوړولو محافظتي اغیزه ښیې.
په ټوله کې، هغه معلومات چې موږ یې دلته چمتو کوو ښیي چې د MFN2 بیا څرګندونه کولی شي په بشپړ ډول پرمختللي PN د شدید OXPHOS کمښت، شدید mtDNA کمښت، او خورا غیر معمولي اسټا په څیر مورفولوژي سره وژغوري، پدې توګه حتی په پرمختللو ناروغیو کې دوامداره پرمختګ چمتو کوي. نیوروډیجنریشن د حجرو د مړینې دمخه د مرحلې بیرته راګرځیدونکي شواهد چمتو کوي. د میټابولیک انعطاف دا درجې د نیورونونو د ایتروسکلروسیس هڅولو وړتیا لخوا نور هم ټینګار کیږي (د TCA دورې بیا رغونه)، کوم چې د OXPHOS نشتوالي PNs کې د PCx څرګندونه منع کوي او د حجرو مړینه زیاتوي، په دې توګه محافظتي رول لوبوي (شکل 5F).
په دې څیړنه کې، موږ شواهد وړاندې کړل چې د OXPHOS اختلال ته د PNs غبرګون په تدریجي ډول د میټابولیک پروګرامونو لخوا فعال شوي د توپیر فعالولو لارې له لارې د TCA دورې ایتروسکلروسیس ته بدلیږي. موږ د ډیری تکمیلي میتودونو سره د پروټومیک تحلیل تایید کړ او څرګنده یې کړه چې کله د شدید مایټوکونډریال اختلال لخوا ننګول کیږي، نیورونونه د میټابولیک لچک یوه پخوانۍ نامعلومه بڼه لري. زموږ د حیرانتیا لپاره، د بیا رغونې ټوله پروسه اړینه نه ده چې د ټرمینل میټابولیک حالت په نښه کړي چې د نیوروډیجنریشن سره په تدریجي او نه بدلیدونکي ډول مل وي، مګر زموږ معلومات وړاندیز کوي چې دا ممکن د حجرو د مړینې دمخه په مرحله کې د ساتنې نیورون جوړ کړي د فعال جبران میکانیزم. دا موندنه ښیي چې نیورونونه په بدن کې د میټابولیک پلاستیکیت د پام وړ درجې لري. دا حقیقت ثابتوي چې د MFN2 وروسته بیا معرفي کول کولی شي د کلیدي میټابولیک نښه کونکو څرګندونه بیرته راولي او د PN تخریب مخه ونیسي. برعکس، دا ایتروسکلروسیس مخنیوی کوي او اعصاب ګړندي کوي. ټرانس جنس.
زموږ په څیړنه کې یو له خورا په زړه پورې موندنو څخه دا ده چې د OXPHOS نشتوالی لرونکي PNs کولی شي د TCA دورې میټابولیزم د انزایمونو تنظیم کولو له لارې تعدیل کړي چې په ځانګړي ډول د شریانونو سکلیروسیس هڅوي. میټابولیک بیا تنظیم کول د سرطان حجرو یوه عامه ځانګړتیا ده، چې ځینې یې په ګلوټامین تکیه کوي ترڅو د TCA دورې منځګړیتوبونه بشپړ کړي ترڅو د کمولو مساوي تولید کړي، کوم چې د تنفسي سلسله چلوي او د لیپید او نیوکلیوټایډ بایوسینتیسس مخکیني تولید ساتي (39، 40). یوې وروستۍ مطالعې ښودلې چې په هغو پردیو نسجونو کې چې د OXPHOS اختلال تجربه کوي، د ګلوټامین/ګلوټامیټ میټابولیزم بیا نښلول هم یو مهم ځانګړتیا ده (5، 41)، چیرې چې د TCA دورې ته د ګلوټامین ننوتلو لارښوونه د OXPHOS ټپ د شدت له امله پورې اړه لري (41). په هرصورت، په بدن کې د نیورونال میټابولیک پلاستیکیت د کوم ورته والي او د ناروغۍ په شرایطو کې د هغې احتمالي تړاو په اړه د روښانه شواهدو نشتوالی شتون لري. په یوه وروستي ان ویټرو مطالعې کې، لومړني کورټیکل نیورونونه ښودل شوي چې د نیوروټرانسمیشن لپاره د ګلوټامیټ حوضونه متحرک کوي، په دې توګه د میټابولیک فشار شرایطو لاندې اکسیډیټیو میټابولیزم او ایتروسکلروسیس هڅوي (42). دا د یادونې وړ ده چې د TCA سایکل انزایم سوکسینیټ ډیهایډروجنیز د فارماسولوژیکي مخنیوي لاندې، د پیروویټ کاربوکسیلیشن باور کیږي چې په کلتور شوي سیریبیلر ګرانول نیورونونو کې د آکسالواسیټیټ ترکیب ساتي (34). په هرصورت، د دماغ نسجونو سره د دې میکانیزمونو فزیولوژیکي تړاو (چیرې چې ایتروسکلروسیس په عمده توګه د اسټروسایټونو پورې محدود دی) لاهم مهم فیزیولوژیکي اهمیت لري (43). پدې حالت کې، زموږ معلومات ښیې چې په بدن کې د OXPHOS لخوا زیانمن شوي PNs کولی شي د BCAA تخریب او پیروویټ کاربوکسیلیشن ته واړول شي، کوم چې د TCA حوض منځګړیو د بشپړولو دوه اصلي سرچینې دي. که څه هم د نیورونال انرژي میتابولیزم ته د BCAA کیټابولیزم احتمالي ونډه وړاندیز شوې، د نیوروټرانسمیشن لپاره د ګلوټامیټ او GABA رول سربیره (44)، لاهم په ویوو کې د دې میکانیزمونو لپاره هیڅ شواهد شتون نلري. له همدې امله، دا اټکل کول اسانه دي چې غیر فعال PNs کولی شي په اتوماتيک ډول د TCA منځګړیو مصرف لپاره تاوان ورکړي چې د ایتروسکلروسیس زیاتوالي سره د جذب پروسې لخوا پرمخ وړل کیږي. په ځانګړې توګه، د PCx لوړ تنظیم ممکن د اسپارټیک اسید لپاره د زیاتې غوښتنې ساتلو لپاره اړین وي، کوم چې د مایټوکونډریال اختلال سره د حجرو د تکثیر لپاره وړاندیز کیږي (45). په هرصورت، زموږ د میټابولومیک تحلیل په Mfn2cKO PNs (شکل S6A) کې د اسپارټیک اسید د ثابت حالت کچه ​​کې کوم مهم بدلونونه نه دي څرګند کړي، کوم چې احتمال لري د تکثیر حجرو او پوسټ مایټوټیک نیورونونو ترمنځ د اسپارټیک اسید مختلف میټابولیک کارول منعکس کوي. که څه هم په ویوو کې د غیر فعال نیورونونو کې د PCx لوړ تنظیم دقیق میکانیزم لاهم مشخص شوی نه دی، موږ ښودلې چې دا وخت دمخه غبرګون د نیورونونو د ریډوکس حالت ساتلو کې مهم رول لوبوي، کوم چې د سیریبیلر سلائسونو په FLIM تجربو کې ښودل شوی. په ځانګړې توګه، د PCx لوړ تنظیم کولو څخه د PNs مخنیوی کولی شي د ډیر اکسیډیز شوي حالت لامل شي او د حجرو مړینه ګړندۍ کړي. د BCAA تخریب فعالول او د پیروویټ کاربوکسیلیشن د مایټوکونډریال اختلال د پردیي نسجونو ځانګړتیا کولو لارې ندي (7). له همدې امله، داسې ښکاري چې دوی د OXPHOS کمښت لرونکي نیورونونو لومړیتوب ځانګړتیا ده، حتی که یوازینۍ ځانګړتیا نه وي، کوم چې د نیوروډیجنریشن لپاره مهم دی. .
د سیریبیلر ناروغي د عصبي ناروغیو یو متفاوت ډول دی چې معمولا د اټکسیا په توګه څرګندیږي او ډیری وختونه PNs ته زیان رسوي (46). دا د نیورون نفوس په ځانګړي ډول د مایټوکونډریال اختلال لپاره زیان منونکی دی ځکه چې په موږکانو کې د دوی انتخابي تخریب د ډیری موټرو نښو تولید لپاره کافي دی چې د انسان سپینوسیریبیلر اټاکسیا ځانګړتیا لري (16، 47، 48). د راپورونو له مخې، د متغیر جین سره د ټرانسجینک موږک ماډل د انسان سپینوسیریبیلر اټاکسیا سره تړاو لري او د مایټوکونډریال اختلال لري (49، 50)، چې په PNPH کې د OXPHOS کمښت پایلو مطالعې اهمیت ټینګار کوي. له همدې امله، دا په ځانګړي ډول مناسب دی چې د دې ځانګړي نیورون نفوس په مؤثره توګه جلا او مطالعه کړئ. په هرصورت، په پام کې نیولو سره چې PNs د فشار سره خورا حساس دي او د ټول سیریبیلر حجرو نفوس ټیټ تناسب حساب کوي، د ډیری اومیکس پر بنسټ مطالعاتو لپاره، د بشپړ حجرو په توګه د دوی انتخابي جلا کول لاهم یو ننګونکی اړخ دی. که څه هم د نورو حجرو ډولونو (په ځانګړي توګه د لویانو نسجونو) د ککړتیا مطلق کمښت ترلاسه کول تقریبا ناممکن دي، موږ د FACS سره د اغیزمن جلا کولو مرحله یوځای کړه ترڅو د ښکته جریان پروټومیک تحلیل لپاره کافي شمیر وړ نیورونونه ترلاسه کړو، او د ټول سیریبیلم (51) د موجوده ډیټا سیټ په پرتله خورا لوړ پروټین پوښښ (شاوخوا 3000 پروټینونه) لرو. د ټولو حجرو د وړتیا ساتلو سره، هغه طریقه چې موږ یې دلته چمتو کوو موږ ته اجازه راکوي چې نه یوازې په مایتوکونډریا کې د میټابولیک لارو کې بدلونونه وګورو، بلکه د هغې د سایټوپلاسمیک همکارانو کې بدلونونه هم وګورو، کوم چې د حجرو ډول بډایه کولو لپاره د مایتوکونډریا جھلی ټګونو کارول بشپړوي. په پیچلو نسجونو کې د مایتوکونډریا د شمیر لپاره نوې طریقه (52، 53). هغه طریقه چې موږ یې تشریح کوو نه یوازې د پورکینجي حجرو مطالعې پورې اړه لري، بلکه په اسانۍ سره د هر ډول حجرو لپاره پلي کیدی شي ترڅو په ناروغ دماغونو کې میټابولیک بدلونونه حل کړي، پشمول د مایتوکونډریا د اختلال نور ماډلونه.
په پای کې، موږ د دې میټابولیک بیا تنظیم کولو پروسې په جریان کې د درملنې کړکۍ پیژندلې چې کولی شي د حجروي فشار کلیدي نښې په بشپړ ډول بیرته راوباسي او د عصبي تخریب مخه ونیسي. له همدې امله، دلته تشریح شوي د بیا وایر کولو فعال اغیزو پوهیدل ممکن د مایټوکونډریال اختلال په جریان کې د عصبي وړتیا ساتلو لپاره د ممکنه درملنې لپاره بنسټیز بصیرت چمتو کړي. راتلونکې څیړنې ته اړتیا ده چې هدف یې د دماغ د حجرو په نورو ډولونو کې د انرژۍ میټابولیزم کې بدلونونه تحلیل کول دي ترڅو د دې اصل تطبیق په بشپړ ډول نورو عصبي ناروغیو ته څرګند شي.
د میتو پارک موږکان مخکې تشریح شوي دي (31). د C57BL/6N موږکان چې د loxP سره د Mfn2 جینونو سره تړاو لري مخکې تشریح شوي دي (18) او د L7-Cre موږکانو سره تیر شوي دي (23). پایله لرونکي دوه ګونی هیټروزایګوس اولاد بیا د هوموزایګوس Mfn2loxP/Mfn2loxP موږکانو سره تیر شوي ترڅو د Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) لپاره د پورکینجي ځانګړي جین ناک آوټ رامینځته کړي. د ملګرتیا په یوه فرعي برخه کې، د Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ایلیل (stop-mtYFP) د اضافي کراسینګونو له لارې معرفي شو (20). د څارویو ټولې کړنلارې د اروپایی، ملي او اداري لارښوونو سره سم ترسره شوې او د جرمني د شمالي راین-ویسټفالیا د امویلټ او وربروچرچټز د لینډیسامټفور ناټور لخوا تصویب شوې. د څارویو کار د اروپایی لابراتوار د څارویو علومو اتحادیو فدراسیون لارښوونې هم تعقیبوي.
د امیندواره میرمنې د رحم د غاړې د بې هوشۍ وروسته، د موږک جنین جلا کیږي (E13). کورټیکس د هینکس متوازن مالګې محلول (HBSS) کې د 10 ملي میتر هیپس سره ضمیمه شوی او د ډلبیکو د تعدیل شوي ایګل میډیم ته لیږدول شوی چې پاپین (20 U/ml) او سیستین (1μg/ml) لري. نسج په DMEM کې واچوئ) او د انزایمیک هضم له لارې یې جلا کړئ. Ml) د 20 دقیقو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې، او بیا په میخانیکي ډول د DMEM کې د 10٪ جنین غواګانو سیرم سره ضمیمه شوی. حجرې د شیشې پوښونو کې تخم شوي چې د پولی لیسین سره پوښل شوي د 2×106 په هر 6 سانتي مترو کلتوري ډش کې یا د 0.5×105 حجرو/cm2 کثافت کې د عکس اخیستنې تحلیل لپاره. د 4 ساعتونو وروسته، میډیم د نیوروباسال سیرم فری میډیم سره بدل شو چې 1٪ B27 ضمیمه او 0.5 ملي میتر ګلوټا میکس لري. بیا نیورونونه د تجربې په اوږدو کې په 37 درجو سانتي ګراد او 5٪ CO2 کې ساتل شوي وو، او په اونۍ کې یو ځل تغذیه شوي وو. د بیا ترکیب هڅولو لپاره، د لاندې AAV9 ویروس ویکتور 3μl (24-څاه کلتور ډش) یا 0.5μl (24-څاه پلیټ) د ان ویټرو په دویمه ورځ د نیورونونو درملنې لپاره کارول شوي وو: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene، د کتلاګ شمیره 105530-AAV9) او AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene، د کتلاګ شمیره 105545-AAV9).
د موږک Mfn1 او Mfn2 بشپړونکي DNA (په ترتیب سره د اډجین پلازمیډ #23212 او #23213 څخه ترلاسه شوي) د C-ټرمینس کې د V5 ترتیب (GKPIPNPLLGLDST) سره نښه شوي، او د T2A ترتیب له لارې په چوکاټ کې د mCherry سره یوځای شوي دي. Grx1-roGFP2 د هایډلبرګ TP ډیک DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) څخه ډالۍ ده. د دودیزو کلونینګ میتودونو په کارولو سره د tdTomato کیسیټ ځای په ځای کولو سره، کیسیټ د pAAV-CAG-FLEX-tdTomato بیکبون (د اډجین حوالې شمیره 28306) کې فرعي کلون شو ترڅو pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5، pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 او pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ویکتورونه تولید کړي. د کنټرول ویکتور pAAV-CAG-FLEX-mCherry تولید لپاره ورته ستراتیژي کارول شوې وه. د AAV-shPCx جوړښت د تولید لپاره، د پلازمیډ AAV ویکتور (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ته اړتیا ده، کوم چې د shRNA هدف موندونکي PCx (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) کوډ کولو سره د DNA ترتیب لري. د U6 پروموټر کنټرول لاندې، mCherry د CMV پروموټر کنټرول لاندې کارول کیږي. د مرستندویه AAV ویکتورونو تولید د جوړونکي لارښوونو (سیل بایولابز) سره سم ترسره شو. په لنډه توګه، د لیږد پلازمیډ څخه کار واخلئ چې mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)، mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) لیږدوي. د 293AAV حجرو-T2A-MFN1-V5)، mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) یا Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) کوډینګ جین انتقال کړئ، او همدارنګه د AAV1 کیپسید پروټین او اضافي پروټین کوډ کول. د پلازمید بسته بندي، د کلسیم فاسفیټ میتود په کارولو سره. خام ویروس سوپرناټینټ د وچ یخ / ایتانول حمام کې د فریز-تو دورې او د فاسفیټ بفر شوي مالګین (PBS) کې د لایز شوي حجرو لخوا ترلاسه شو. د AAV ویکتور د غیر متواتر آیوډیکسانول ګریډینټ الټراسنټرفیوګیشن (24 ساعته په 32,000 rpm او 4°C کې) لخوا پاک شو او د امیکون الټرا-15 سینټرفیوګال فلټر په کارولو سره متمرکز شو. د AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 جینوم کاپي (GC)/ml]، AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml)، AAV1-CAG-FLEX د جینوم ټایټر لکه څنګه چې مخکې تشریح شوی و (54)، د ریښتیني وخت کمیتي PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) او AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) لخوا اندازه شوی.
لومړني نیورونونه په یخ سړه 1x PBS کې سکریپ شوي، ګولۍ شوي، او بیا په 0.5٪ Triton X-100 / 0.5٪ سوډیم ډیوکسیکولیټ / PBS لیسیز بفر کې چې فاسفیټیس او پروټیز انابیټر (روچ) لري همجنس شوي. د پروټین اندازه کول د بایچینکونیک اسید ازموینې (ترمو فشر ساینسي) په کارولو سره ترسره شوي. بیا پروټینونه د SDS-polyacrylamide جیل الیکروفوریسس لخوا جلا شوي، او بیا د پولی وینیلایډین فلورایډ جھلی (GE روغتیا پاملرنې) باندې داغ شوي. غیر مشخص ځایونه بند کړئ او د لومړني انټي باډي سره انکیوبیټ کړئ (د جزیاتو لپاره جدول S1 وګورئ) په TBST کې 5٪ شیدو کې (د ټوین سره د ټریس بفر شوي مالګین)، د مینځلو مرحلې او ثانوي انټي باډي په TBST انکیوبیټ کې. د شپې په +4 درجو سانتی ګراد کې د لومړني انټي باډي سره انکیوبیټ کړئ. د مینځلو وروسته، ثانوي انټي باډي د خونې په حرارت کې د 2 ساعتونو لپاره تطبیق کړئ. وروسته، د انټي-β-ایکټین انټي باډي سره ورته بلاټ انکیوبیټ کولو سره، ورته بار کول تایید شول. د کیمیلومینیسینس په بدلولو او د کیمیلومینیسینس لوړولو (GE Healthcare) له لارې کشف.
هغه نیورونونه چې مخکې د شیشې پوښونو کې تخم شوي وو د 4٪ پارافارمالډیهایډ (PFA)/PBS سره د خونې د حرارت درجه کې د 10 دقیقو لپاره په ټاکل شوي وخت کې تنظیم شوي وو. پوښونه لومړی د 0.1٪ ټریټون X-100/PBS سره د خونې د حرارت درجه کې د 5 دقیقو لپاره داخل شوي، او بیا په بلاکینګ بفر کې [3٪ د غواګانو سیرم البومین (BSA)/PBS]. په دویمه ورځ، پوښونه د بلاکینګ بفر سره مینځل شوي او د خونې د حرارت درجه کې د 2 ساعتونو لپاره د مناسب فلوروفور-کنجوګیټ شوي ثانوي انټي باډي سره مینځل شوي؛ په پای کې، نمونې په PBS کې د 4′,6-diamidino-2 سره په بشپړه توګه مینځل شوي -Phenylindole (DAPI) کاونټرسټاین شوی او بیا د مایکروسکوپ سلایډ کې د اکوا-پولی/ماونټ سره تنظیم شوی.
موږکان (نارینه او ښځینه) د کیټامین (۱۳۰ ملی ګرامه/کیلوګرام) او زایلازین (۱۰ ملی ګرامه/کیلوګرام) د انټراپیریتونیل انجیکشن په واسطه بې هوشي شول او د کارپروفین انالجیسک (۵ ملی ګرامه/کیلوګرام) سره په فرعي ډول اداره شول، او په یوه سټیریوټیکټیک وسیله (کوپف) کې ځای په ځای شول چې د ګرم پیډ سره سمبال وو. کوپړۍ ښکاره کړئ او د غاښونو ډرل وکاروئ ترڅو د مس هډوکي سره مطابقت لرونکي د سیریبیلر کورټیکس برخه پتلې کړئ (د لامبډا څخه: لکۍ ۱.۸، اړخ ۱، د لوبول IV او V سره مطابقت لري). د منحني سرنج ستنې څخه کار واخلئ ترڅو په احتیاط سره په کوپړۍ کې یو کوچنی سوری جوړ کړئ ترڅو لاندې رګونو ګډوډ نشي. بیا د شیشې نری رنګ شوی کیپلیري ورو ورو مایکرو سوري ته داخلیږي (د ډیورا میټر په وینټرل اړخ کې -1.3 څخه -1 پورې)، او له 200 څخه تر 300 nl AAV د لاسي سرنجونو (ناریشیج) سره د مایکرو انجیکټر (ناریشیج) کې څو ځله د 10 څخه تر 20 دقیقو کړکۍ په موده کې په ټیټ فشار کې داخل کیږي. د انفیوژن وروسته، کیپلیري د نورو 10 دقیقو لپاره ځای په ځای کړئ ترڅو ویروس په بشپړ ډول خپور شي. وروسته له هغه چې کیپلیري بیرته واخیستل شي، پوټکی په احتیاط سره ګنډل کیږي ترڅو د زخم سوزش کم کړي او څاروی ته اجازه ورکړي چې روغ شي. د عملیاتو وروسته د څو ورځو لپاره څارویو ته د درد ضد درمل (کاسپوفین) سره درملنه وشوه، په دې موده کې د دوی فزیکي حالت په احتیاط سره وڅارل شو او بیا دوی په ټاکل شوي وخت کې euthanized شول. ټولې پروسیجرونه د اروپایی، ملي او اداري لارښوونو سره سم ترسره شوي او د جرمني د شمالي راین-ویسټفالیا، امویلټ او وربروچرچټز د لینډیسامټفور ناټور لخوا تصویب شوي.
څاروي د کیټامین (۱۰۰ ملی ګرامه/کیلوګرام) او زایلازین (۱۰ ملی ګرامه/کیلوګرام) سره بې هوشي شول، او زړه یې لومړی د ۰.۱ ملی ګرامه PBS سره او بیا په PBS کې د ۴٪ PFA سره پرفیوز شو. نسج د شپې په ۴ درجو سانتی ګراد کې په ۴٪ PFA/PBS کې جلا او ثابت شو. یو وایبریټینګ چاقو (لیکا مایکروسیسټمز GmbH، ویانا، اتریش) د PBS کې د ثابت دماغ څخه د سیګیټل برخې (۵۰ μm ضخامت) چمتو کولو لپاره کارول شوی و. پرته لدې چې بل ډول مشخص شي، د آزادو لامبو وهونکو برخو رنګ کول د پورته تشریح شوي (۱۳) په څیر ترسره شوي لکه څنګه چې د خونې په تودوخه کې او حرکت کول. په لنډه توګه، لومړی، ترلاسه شوي ټوټې د خونې په تودوخه کې د ۱۵ دقیقو لپاره د ۰.۵٪ Triton X-100/PBS سره نفوذ شوي؛ د ځینو ایپیټوپونو لپاره (Pcx او Shmt2)، د ۸۰ درجو سانتی ګراد (PH 9) کې د tris-EDTA بفر لخوا د دې مرحلې پرځای د ۲۵ دقیقو لپاره ټوټې ګرمې کړئ. بیا، برخې د لومړني انټي باډي سره انکیوبیټ شوې (جدول S1 وګورئ) په بلاکینګ بفر (3٪ BSA/PBS) کې د شپې په 4 درجو سانتی ګراد کې د هڅولو سره. بله ورځ، برخې د بلاکینګ بفر سره ومینځل شوې او د خونې په تودوخه کې د 2 ساعتونو لپاره د مناسب فلوروفور-کنجوګیټ شوي ثانوي انټي باډي سره انکیوبیټ شوې؛ په پای کې، برخې په PBS کې په بشپړه توګه ومینځل شوې، د DAPI سره کاونټر سټین شوې، او بیا د مایکروسکوپ سلایډ کې د اکوا پولی ماونټ سره تنظیم شوې.
د نمونې د انځور کولو لپاره د لیزر سکین کولو کنفوکال مایکروسکوپ (TCS SP8-X یا TCS ډیجیټل رڼا پاڼه، لایکا مایکروسیسټم) کارول شوی و چې د سپینې رڼا لیزر او 405 ډایډ الټرا وایلیټ لیزر سره سمبال و. د فلوروفور په هڅولو او د هایبرډ ډیټیکټر (HyDs) سره د سیګنال راټولولو سره، LAS-X سافټویر د ترتیب حالت کې د Nyquist نمونې سره سم سټیک شوي عکسونو راټولولو لپاره کارول شوی و: د غیر کمیتي پینلونو لپاره، دا خورا متحرک سیګنالونه دي (د مثال په توګه، په سوماتیک حجرو او ډینډریټونو کې) mtYFP) د BrightR حالت کې د PNs شمیر کشف کولو لپاره HyD وکاروئ). د شالید کمولو لپاره له 0.3 څخه تر 6 ns پورې ګیټینګ پلي کیږي.
د ترتیب شوي حجرو ریښتیني وخت عکس اخیستل. د نیوروباسال-A میډیم کې د ترتیب کولو وروسته چې 1٪ B27 ضمیمه او 0.5 mM ګلوټا میکس لري، حجرې سمدلاسه د پولی-ایل-لائسین لیپت شوي شیشې سلایډونو (μ-Slide8 Well، Ibidi، د کتلاګ شمیره 80826) کې تخم شوي، او بیا یې د 1 ساعت لپاره په 37 درجو سانتي ګراد او 5٪ CO2 کې وساتئ ترڅو حجرو ته اجازه ورکړي چې ځای په ځای شي. ریښتیني وخت عکس اخیستل د لییکا SP8 لیزر سکین کولو کنفوکال مایکروسکوپ کې ترسره شوي چې د سپین لیزر، HyD، 63×[1.4 عددي اپرچر (NA)] تیلو مقصدي لینز او د تودوخې مرحلې سره سمبال شوي.
موږک په چټکۍ سره د کاربن ډای اکسایډ سره بې هوشي شو او سر یې پرې شو، دماغ په چټکۍ سره له کوپړۍ څخه لرې شو، او په 200μm ضخامت (د 13C لیبل کولو تجربې لپاره) یا 275μm ضخامت (د دوو فوټون تجربو لپاره) کې پرې شو. د سیګیټل برخه د لاندې موادو څخه ډکه شوه. آیس کریم (HM-650 V، ترمو فشر ساینټیفیک، والډورف، جرمني) د لاندې موادو څخه ډک شوی: 125 mM یخ سړه، کاربن-سیچوریٹډ (95٪ O2 او 5٪ CO2) ټیټ Ca2 + مصنوعي دماغي نخاعي مایع (ACSF) NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوډیم فاسفیټ بفر، 25 mM NaHCO3، 25 mM ګلوکوز، 0.5 mM CaCl2 او 3.5 mM MgCl2 (د 310 څخه تر 330 mmol پورې د اوسموټیک فشار). ترلاسه شوي دماغي ټوټې د انکیوبیشن دمخه خونې ته انتقال کړئ چې لوړ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوډیم فاسفیټ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-ګلوکوز، 1.0 mM CaCl2 او 2.0 mM MgCl2 (متوسط) pH 7.4 او 310 څخه تر 320 mmol) ولري.
د انځور کولو پروسې په جریان کې، ټوټې د انځور کولو لپاره وقف شوي خونې ته لیږدول شوي، او تجربه د 32° څخه تر 33°C پورې د دوامداره ACSF پرفیوژن لاندې ترسره شوه. د ملټي فوټون لیزر سکین کولو مایکروسکوپ (TCS SP8 MP-OPO، Leica Microsystems) چې د Leica 25x مقصدي لینز (NA 0.95، اوبه)، Ti: Sapphire لیزر (Chameleon Vision II، Coherent) سره سمبال شوی و د ټوټې انځور کولو لپاره کارول شوی و. د FLIM ماډل (PicoHarp300، PicoQuant).
د Grx1-roGFP2 FLIM. د PNs د سایتوپلاسمیک ریډوکس حالت کې بدلونونه د دوه فوټون FLIM لخوا د سیګیټل دماغ سلائسونو کې اندازه شوي، چیرې چې Grx1-roGFP2 بایوسینسر PNs په نښه کړي. د PN طبقه کې، د استملاک ساحه د سلائس سطحې لاندې شاوخوا 50 څخه تر 80 μm پورې غوره کیږي ترڅو ډاډ ترلاسه شي چې یو عملي PN شتون لري (یعنې د ډینډریټونو په اوږدو کې د مڼو جوړښت یا نیورونال مورفولوژیکي بدلونونو نشتوالی) او دوه ګونی مثبت roGFP2 سینسر او AAV کوډ کول shRNA PCx یا د هغې کنټرول ترتیب (هر یو شریک څرګندونکی mCherry). د 2x ډیجیټل زوم سره د واحد سټیک عکسونه راټول کړئ [د هڅونې طول موج: 890 nm؛ 512 nm 512 پکسلز]. کشف: داخلي HyD، فلوروسین اسوتیوسایانټ (FITC) فلټر ګروپ] او د 2 څخه تر 3 دقیقو کې د عکس اوسط کارول کیږي ترڅو ډاډ ترلاسه شي چې کافي فوټونونه راټول شوي (په ټولیز ډول 1000 فوټونونه) د منحني فټینګ لپاره. د Grx1-roGFP2 پروب حساسیت او د FLIM شرایطو تایید د roGFP2 د عمر ارزښت څارنه کولو سره ترسره شو کله چې د پرفیوژن ACSF ته د خارجي 10 mM H2O2 اضافه کول (د اکسیډیشن اعظمي کولو لپاره، د عمر زیاتوالي لامل کیږي)، او بیا د 2 mM ډیتیوتریټول اضافه کول (د کمښت درجې کموي، چې د عمر کمښت لامل کیږي) (شکل S8، D څخه G ته). د ترلاسه شوي پایلو تحلیل لپاره د FLIMfit 5.1.1 سافټویر وکاروئ، د ټول عکس واحد کثافاتي تخریب منحنی اندازه شوي IRF (د وسیلې غبرګون فعالیت) سره فټ کړئ، او χ2 نږدې 1 دی. د یو واحد PN د ژوند موده محاسبه کولو لپاره، د اعصابو بدن شاوخوا ماسک په لاسي ډول رسم شوی و، او په هر ماسک کې اوسط ژوند موده د مقدار کولو لپاره کارول شوې وه.
د مایټوکونډریال احتمالي تحلیل. وروسته له هغه چې حاد برخه د 100 nM TMRM سره په مستقیم ډول د 30 دقیقو لپاره په پرفیوز شوي ACSF کې اضافه شوه، د PNs د مایټوکونډریال احتمالي بدلونونه د دوه فوټون مایکروسکوپ لخوا اندازه شول. د TMRM امیجنگ د 920 nm په جریان کې د پروب په هڅولو او د داخلي HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) په کارولو سره د سیګنالونو راټولولو لپاره ترسره شو؛ د ورته جوش طول موج په کارولو سره مګر د mtYFP عکس اخیستلو لپاره د مختلف داخلي HyD (FITC :525/50) په کارولو سره. د واحد حجرو په کچه د مایټوکونډریال احتمالي ارزولو لپاره د ImageJ د عکس کیلکولیټر پلگ ان وکاروئ. په لنډه توګه، د پلګ ان معادله: سیګنال = دقیقه (mtYFP، TMRM) د مایټوکونډریال سیمې پیژندلو لپاره کارول کیږي چې د اړونده چینل د واحد سټیک کنفوکال عکس کې په پورکینجي سومالیا کې د TMRM سیګنال ښیې. بیا په پایله کې د ماسک کې د پکسل ساحه اندازه کیږي، او بیا د mtYFP چینل د اړونده حد واحد سټیک عکس کې نورمال کیږي ترڅو د مایټوکونډریال کسر ترلاسه کړي چې د مایټوکونډریال پوټینشن ښیې.
انځور د هیوګینس پرو (ساینټيفک والیوم امیجینګ) سافټویر په کارولو سره جلا شو. د ټایلونو سکین شوي عکسونو لپاره، د LAS-X سافټویر لخوا چمتو شوي اتوماتیک ګنډلو الګوریتم په کارولو سره د یو واحد ټایل مونټیج جوړ شوی. د عکس کیلیبریشن وروسته، د عکس نور پروسس کولو لپاره ImageJ او Adobe Photoshop وکاروئ او په مساوي ډول روښانتیا او برعکس تنظیم کړئ. د ګرافیک چمتو کولو لپاره Adobe Illustrator وکاروئ.
د mtDNA تمرکز تحلیل. د mtDNA زخمونو شمیر د کنفوکال مایکروسکوپ لخوا د DNA په وړاندې د انټي باډیز سره لیبل شوي سیریبیلر برخو کې اندازه شوی. د هر هدف ساحه د حجرو بدن او د هر حجرو نیوکلیوس لپاره رامینځته شوې ، او اړونده ساحه د څو اندازه کولو پلګ ان (ImageJ سافټویر) په کارولو سره محاسبه شوې. د حجرو د بدن ساحې څخه اټومي ساحه کم کړئ ترڅو د سایټوپلازمیک ساحه ترلاسه کړئ. په پای کې، د تحلیل ذرات پلگ ان (ImageJ سافټویر) د سایټوپلازمیک DNA نقطو په اتوماتيک ډول اندازه کولو لپاره کارول شوی و چې د حد عکس کې mtDNA ښیې ، او ترلاسه شوي پایلې د CTRL موږکانو PN اوسط ته نورمال شوي. پایلې د هر حجرو د نیوکلیوسایډونو اوسط شمیر په توګه څرګندیږي.
د پروټین د څرګندولو تحلیل. د ImageJ د انځور کیلکولیټر پلگ ان وکاروئ ترڅو د واحد حجرو په کچه په PN کې د پروټین څرګندونه ارزونه وکړئ. په لنډه توګه، د اړونده چینل د واحد پرت کنفوکال عکس کې، د مساوات له لارې: سیګنال = دقیقه (mtYFP، انټي باډي)، د مایټوکونډریال سیمه چې په پورکینا کې یو ځانګړي انټي باډي ته معافیتي فعالیت ښیې پیژندل کیږي. بیا په پایله کې ماسک کې د پکسل ساحه اندازه کیږي، او بیا د ښودل شوي پروټین د مایټوکونډریال برخې ترلاسه کولو لپاره د mtYFP چینل د اړونده حد واحد سټیک عکس کې نورمال کیږي.
د پورکینجي حجرو کثافت تحلیل. د ImageJ د حجرو کاونټر پلگ ان د پورکینجي کثافت ارزولو لپاره د پورکینجي حجرو شمیر د شمیرل شوي حجرو لخوا نیول شوي سیریبیلر حلقې اوږدوالي سره ویشلو سره کارول شوی و.
د نمونې چمتو کول او راټولول. د کنټرول ګروپ او Mfn2cKO موږکانو دماغونه په 0.1 M فاسفیټ بفر (PB) کې په 2% PFA/2.5% ګلوټارالډیهایډ کې تنظیم شوي، او بیا د مرجان برخې د سیلیټونو په کارولو سره چمتو شوي (لیکا مایکروسیسټم GmbH، ویانا، اتریش) (ضخامت 50 څخه تر 60 μm) بیا د PB بفر کې د خونې په تودوخه کې د 1 ساعت لپاره په 1% os tetraoxide او 1.5% پوټاشیم فیروکیانایډ کې تنظیم شوي. برخې درې ځله د تشو اوبو سره مینځل شوي، او بیا د 70% ایتانول سره رنګ شوي چې 1% یورانیل اسټیټ لري د 20 دقیقو لپاره. برخې بیا په درجه بندي شوي الکول کې ډیهایډریټ شوي او د سیلیکون پوښل شوي شیشې سلایډونو ترمنځ په دورکوپان ACM (اراالډایټ کاسټینګ رال M) ایپوکسی رال (الیکټرون مایکروسکوپي ساینسز، د کتلاګ شمیره 14040) کې ځای په ځای شوي، او په پای کې په 60°C کې د 48 ساعتونو لپاره په تنور کې پولیمرائز کړئ. د دماغي کورټیکس ساحه غوره شوه او په لییکا الټرا کټ (لییکا مایکروسیسټم GmbH، ویانا، اتریش) کې 50 نانومیټره الټرا پتلي برخې پرې شوې او د 2×1 ملي میتر مسو سلیټ ګریډ باندې غوره شوې چې د پولیټیرین فلم سره پوښل شوې وه. برخې د 10 دقیقو لپاره په H2O کې د 4٪ یورانیل اسیټیټ محلول سره رنګ شوې، څو ځله د H2O سره مینځل شوې، بیا د 10 دقیقو لپاره په H2O کې د رینالډز لیډ سیټریټ سره، او بیا څو ځله د H2O سره مینځل شوې. مایکروګرافونه د TVIPS (ټایټز ویډیو او عکس پروسس کولو سیسټم) ټیم کیم-F416 ډیجیټل کیمرې (TVIPS GmbH، ګوتینګ، امریکا) په کارولو سره د لیږد الکترون مایکروسکوپ فیلیپس CM100 (ترمو فشر ساینسي، والټم، MA، امریکا) سره اخیستل شوي. جرمني).
د هغو موږکانو لپاره چې په AAV اخته شوي وو، دماغ جلا شو او د 1 ملي میتر ضخامت سیګیټل برخې ته پرې شو، او سیریبیلم د فلوروسینس مایکروسکوپ په کارولو سره معاینه شو ترڅو د AAV اخته حلقه وپیژني (یعنې، mCherry expressing). یوازې هغه تجربې کارول کیږي چې پکې AAV انجیکشن د پورکینجي حجرو طبقې (یعنې نږدې ټوله طبقه) د لږترلږه دوه پرله پسې سیریبیلر حلقو کې د لیږد خورا لوړ موثریت پایله لري. د AAV لیږد شوی لوپ د شپې وروسته فکسیشن لپاره مایکرو ډیسکټ شوی و (4٪ PFA او 2.5٪ ګلوټارالډیهایډ په 0.1 M کوکوټ بفر کې) او نور پروسس شوی و. د EPON سرایت کولو لپاره، ثابت نسج د 0.1 M سوډیم کوکوټ بفر (Applichem) سره مینځل شوی و، او د 2٪ OsO4 (os، ساینس خدماتو؛ Caco) سره په 0.1 M سوډیم کوکوټ بفر (Applichem) کې 4 ساعتونو لپاره انکیوبیټ شوی و، بیا د 2 ساعتونو لپاره مینځل شوی و. د 0.1 M کوکامایډ بفر سره 3 ځله تکرار کړئ. وروسته، د ایتانول د پورته تلونکې لړۍ څخه د هر ایتانول محلول د 4 درجو سانتي ګراد په تودوخه کې د 15 دقیقو لپاره د نسج د ډیهایډریټ کولو لپاره کار واخیستل شو. نسج پروپیلین اکسایډ ته لیږدول شوی و او د شپې لخوا په EPON (سیګما-الډریچ) کې په 4 درجو سانتي ګراد کې اچول شوی و. نسج د خونې په تودوخه کې د 2 ساعتونو لپاره په تازه EPON کې ځای په ځای کړئ، او بیا یې د 72 ساعتونو لپاره په 62 درجو سانتي ګراد کې ځای په ځای کړئ. د 70 nm الټرا پتلو برخو پرې کولو لپاره الټرا مایکروټوم (لییکا مایکروسیسټمز، UC6) او د الماس چاقو (ډیاتوم، بییل، سویزرلینډ) وکاروئ، او د 1.5٪ یورانیل اسټیټ سره د 15 دقیقو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې رنګ کړئ، او د 4 دقیقو لپاره د لیډ سیټریټ محلول سره رنګ کړئ. د الکترون مایکروګرافونه د JEM-2100 پلس لیږد الکترون مایکروسکوپ (JEOL) په کارولو سره اخیستل شوي چې د کیمرې OneView 4K 16-bit (Gatan) او ډیجیټل مایکروګراف سافټویر (Gatan) سره سمبال دي. د تحلیل لپاره، د الکترون مایکروګرافونه د 5000× یا 10,000× ډیجیټل زوم سره ترلاسه شوي.
د مایټوکونډریا مورفولوژیکي تحلیل. د ټولو تحلیلونو لپاره، د انفرادي مایټوکونډریا شکلونه په لاسي ډول د ImageJ سافټویر په کارولو سره په ډیجیټل عکسونو کې تشریح شوي. مختلف مورفولوژیکي پیرامیټرونه تحلیل شوي. د مایټوکونډریا کثافت د هغه فیصدي په توګه څرګندیږي چې د هر حجرې د ټول مایټوکونډریا ساحې د سایټوپلازم ساحې (سایتوپلازم ساحه = د حجرو ساحه - د حجرو نیوکلیوس ساحه) × 100 لخوا ویشلو سره ترلاسه کیږي. د مایټوکونډریا ګردوالی د فورمول [4π∙ (مساحت / محیط 2)] سره محاسبه کیږي. د مایټوکونډریا اسټا مورفولوژي تحلیل شوې او د دوی اصلي شکلونو سره سم په دوه کټګوریو ("ټیوبلر" او "پوستکی") ویشل شوې.
د آټوفاګوزوم/لیزوزوم شمېر او کثافت تحلیل. د ډیجیټل انځور کې د هر آټوفاګوزوم/لیزوزوم شکلونو په لاسي ډول د نقشې کولو لپاره د ImageJ سافټویر وکاروئ. د آټوفاګوزوم/لیزوزوم ساحه د یوې سلنې په توګه ښودل کیږي چې د هر حجرې د ټول آټوفاګوزوم/لیزوزوم جوړښت ساحه د سایټوپلازم ساحې (سایتوپلازم ساحه = د حجرو ساحه-هیوکلیوس ساحه) × 100 په واسطه ویشلو سره محاسبه کیږي. د آټوفاګوزوم/لیزوزوم کثافت د هر حجرې د آټوفاګوزوم/لیزوزوم جوړښتونو شمیر (د سایټوپلازمیک ساحې له مخې) (سایتوپلازمیک ساحه = د حجرو ساحه-هیوکلي ساحه) لخوا د ټول شمیر ویشلو سره محاسبه کیږي.
د حاد برخې کولو او نمونې چمتو کولو لپاره لیبل کول. د هغو تجربو لپاره چې د ګلوکوز لیبل کولو ته اړتیا لري، د حاد دماغ ټوټې د پری انکیوبیشن چیمبر ته انتقال کړئ، کوم چې سنتر شوي کاربن (95٪ O2 او 5٪ CO2)، لوړ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوډیم فاسفیټ بفر، 25.0 mM NaHCO 3، 25.0 mM d-ګلوکوز، 1.0 mM CaCl 2 او 2.0 mM MgCl 2، د pH 7.4 او 310 څخه تر 320 mOsm پورې تنظیم شوي) لري، په کوم کې چې ګلوکوز 13 C 6- د ګلوکوز بدیل (یوریسوټوپ، د کتلاګ شمیره CLM-1396). د هغو تجربو لپاره چې د پیروویټ لیبل کولو ته اړتیا لري، د دماغ حاد ټوټې لوړ Ca2 + ACSF ته انتقال کړئ (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوډیم فاسفیټ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-ګلوکوز، 1.0 mM CaCl2 او 2.0 mM MgCl2 اضافه کړئ، pH 7.4 او 310 ته 320mOsm ته تنظیم کړئ)، او 1 mM 1-[1-13C] پیروویټ اضافه کړئ (Eurisotop، د کتلاګ شمیره CLM-1082). برخې د 90 دقیقو لپاره په 37 درجو سانتی ګراد کې واچوئ. د تجربې په پای کې، برخې په چټکۍ سره د اوبو محلول (pH 7.4) سره ومینځل شوې چې 75 mM امونیم کاربونیټ لري، او بیا په 40:40:20 (v:v:v) اسیتونیټریل (ACN): میتانول: اوبو کې همجنس شوي. وروسته له دې چې برخې د 30 دقیقو لپاره په یخ کې کیښودل شوې، نمونې په 21,000 ګرامه کې د 10 دقیقو لپاره په 4 درجو سانتیګراد کې سینټرفیوج شوې، او روښانه سپرنټینټ په سپیډ ویک غلظت کې وچ شو. پایله لرونکی وچ میټابولایټ ګولی د تحلیل پورې په -80 درجو سانتیګراد کې زیرمه شو.
د ۱۳ C-لیبل شوي امینو اسیدونو د مایع کروماتګرافي-ماس سپیکٹرومیټري تحلیل. د مایع کروماتګرافي-ماس سپیکٹرومیټري (LC-MS) تحلیل لپاره، میټابولایټ ګولۍ د LC-MS درجې اوبو (هني ویل) په ۷۵μl کې بیا وځنډول شوه. د ۴ درجو سانتی ګراد په تودوخه کې د ۵ دقیقو لپاره په ۲۱،۰۰۰ ګرامه کې د سنټرفیوګیشن وروسته، د روښانه شوي سپرناټینټ ۲۰ μl د امینو اسید فلکس تحلیل لپاره کارول شوی و، پداسې حال کې چې د استخراج پاتې برخه سمدلاسه د انیون تحلیل لپاره کارول شوې وه (لاندې وګورئ). د امینو اسید تحلیل د مخکې تشریح شوي بینزویل کلورایډ ډیرویټیزیشن پروتوکول (۵۵، ۵۶) په کارولو سره ترسره شو. په لومړي ګام کې، د ۱۰۰ ملي میتر سوډیم کاربونیټ (سیګما-الډریچ) ۱۰μl د میټابولایټ استخراج ۲۰μl ته اضافه شو، او بیا د ۲٪ بینزویل کلورایډ (سیګما-الډریچ) ۱۰μl د LC درجې ACN ته اضافه شو. نمونه په لنډه توګه وورټیکس شوه او بیا د 21,000 ګرامه په 5 دقیقو کې په 20 درجو سانتیګراد کې سینټرفیوج شوه. پاک شوی سپرناټینټ د مخروطي شیشې داخلولو (200 μl حجم) سره د 2 ملی لیتر اتومات نمونې بوتل ته انتقال کړئ. نمونې د اکویټي iClass الټرا لوړ فعالیت LC سیسټم (واټرز) په کارولو سره تحلیل شوې چې د Q-Exactive (QE)-HF (الټرا لوړ فیلډ اوربیټراپ) لوړ ریزولوشن دقیق ډله ایز سپیکٹرومیټر (ترمو فشر ساینسي) سره وصل دي. د تحلیل لپاره، د مشتق شوي نمونې 2μl د 100×1.0 ملي میتر لوړ ځواک سیلیکا T3 کالم (واټرز) کې داخل شو چې 1.8μm ذرات لري. د جریان کچه 100μl/min ده، او د بفر سیسټم د بفر A (10 mM امونیم فارمیټ او په اوبو کې 0.15٪ فارمیک اسید) او بفر B (ACN) څخه جوړ دی. تدریجي په لاندې ډول ده: 0٪ B په 0 دقیقو کې؛ 0٪ B. له ۰ څخه تر ۰.۱ دقیقو پورې له ۰ څخه تر ۱۵٪ B پورې؛ له ۰.۱ څخه تر ۰.۵ دقیقو پورې له ۱۵ څخه تر ۱۷٪ B پورې؛ له ۰.۵ څخه تر ۱۴ دقیقو پورې له ۱۷ څخه تر ۵۵٪ پورې؛ له ۵۵ څخه تر ۷۰٪ پورې په ۱۴ څخه تر ۱۴.۵ دقیقو پورې؛ له ۱۴.۵ څخه تر ۷۰ څخه تر ۱۰۰٪ پورې په ۱۸ دقیقو پورې؛ له ۱۸ څخه تر ۱۹ دقیقو پورې له ۱۰۰ څخه تر ۰٪ B پورې په ۱۹ څخه تر ۱۹.۱ دقیقو پورې؛ له ۱۹.۱ څخه تر ۲۸ دقیقو پورې ۰٪ B پورې (۵۵، ۵۶). د QE-HF ډله ایز سپیکٹرومیټر په مثبت ایونیزیشن حالت کې د m/z (د وزن/چارج تناسب) د 50 څخه تر 750 پورې د ډله ایز حد سره کار کوي. پلي شوی ریزولوشن 60,000 دی، او ترلاسه شوی د ګټې کنټرول (AGC) آیون هدف 3×106 دی، او اعظمي ایون وخت 100 ملی ثانیه دی. د تودوخې الیکټرو سپری ایونیزیشن (ESI) سرچینه د 3.5 kV سپری ولټاژ، د کیپلیري تودوخې 250 ° C، د 60 AU (منظم واحدونو) د پوښ هوا جریان، او د 20 AU. 250 ° C معاون هوا جریان کې کار کوي. د S لینز 60 AU ته ټاکل شوی.
د 13C لیبل شوي عضوي اسیدونو د انیون کروماتګرافي-MS تحلیل. پاتې میټابولایټ پریکیټیټ (55μl) د ډایونیکس آیون کروماتګرافي سیسټم (ICS 5000+، ترمو فشر ساینټیفیک) په کارولو سره تحلیل شو چې د QE-HF ډله ایز سپیکٹرومیټر (ترمو فشر ساینټیفیک) سره وصل دی. په لنډه توګه، د میټابولایټ استخراج 5μl د ډایونیکس آیون پیک AS11-HC کالم ته داخل شو چې د HPLC (2 mm × 250 mm، د ذرې اندازه 4μm، ترمو فشر ساینټیفیک) سره سمبال شوی و چې د 1 د ډکولو تناسب سره په پش ان جزوي لوپ حالت کې. ) ډایونیکس آیون پیک AG11-HC ګارډ کالم (2 mm x 50 mm، 4μm، ترمو فشر ساینټیفیک). د کالم تودوخه په 30 درجو سانتي ګراد کې ساتل کیږي، او اتومات نمونه 6 درجو سانتي ګراد ته ټاکل شوې ده. د پوټاشیم هایدروکسایډ کارتریج وکاروئ چې د ډیونیز شوي اوبو سره چمتو شوی ترڅو د ایلیونټ جنراتور له لارې د پوټاشیم هایدروکسایډ ګریډینټ تولید کړي. د میټابولایټونو جلا کول د 380μl/min په جریان کې، د لاندې تدریجي تطبیق سره: 0 څخه تر 3 دقیقو، 10 mM KOH؛ 3 څخه تر 12 دقیقو، 10 څخه تر 50 mM KOH؛ 12 څخه تر 19 دقیقو، 50 څخه تر 100 mM KOH؛ 19 څخه تر 21 دقیقو، 100 mM KOH؛ 21 څخه تر 21.5 دقیقو، 100 څخه تر 10 mM KOH. ستنه د 8.5 دقیقو لپاره د 10 mM KOH لاندې بیا متوازن شوه.
د ستنې وروسته، الیټ شوي میټابولایټونه د 150μl/min ایزوپروپانول ضمیمه جریان سره یوځای کیږي او بیا د لوړ ریزولوشن ماس سپیکټرومیټر ته لیږل کیږي چې په منفي ایونیزیشن حالت کې کار کوي. MS د 60,000 ریزولوشن سره د m/z 50 څخه تر 750 پورې د ماس رینج څارنه کوي. AGC 1×106 ته ټاکل شوی، او د اعظمي ایون وخت په 100 ms کې ساتل شوی. د تودوخې ESI سرچینه د 3.5 kV سپری ولټاژ کې چلول شوې. د ایون سرچینې نور ترتیبات په لاندې ډول دي: د کیپلیري تودوخې 275 ° C؛ د شیټ ګاز جریان، 60 AU؛ د معاون ګاز جریان، 20 AU په 300 ° C کې، او د S لینز تنظیم 60 AU ته.
د ۱۳C لیبل شوي میټابولایټونو د معلوماتو تحلیل. د آاسوټوپ تناسب د معلوماتو تحلیل لپاره د ټریس فائنډر سافټویر (نسخه ۴.۲، ترمو فشر ساینسي) وکاروئ. د هر مرکب پیژندنه د باور وړ حوالې مرکب لخوا تایید شوې او په خپلواکه توګه تحلیل شوې. د آاسوټوپ غني کولو تحلیل ترسره کولو لپاره، د هر ۱۳C آاسوټوپ (Mn) د استخراج شوي ایون کروماتګرام (XIC) ساحه د [M + H] + څخه استخراج شوې، چیرې چې n د هدف مرکب کاربن شمیره ده، چې د امینو اسیدونو تحلیل لپاره کارول کیږي یا [MH] + د انیونونو تحلیل لپاره کارول کیږي. د XIC ډله ایز درستیت په هر ملیون کې له پنځو برخو څخه کم دی، او د RT دقت 0.05 دقیقې دی. د غني کولو تحلیل د هر کشف شوي آاسوټوپ تناسب د اړونده مرکب د ټولو آاسوټوپونو مجموعې سره محاسبه کولو سره ترسره کیږي. دا تناسب د هر آاسوټوپ لپاره د سلنې ارزښتونو په توګه ورکول کیږي، او پایلې د مولر فیصدي غني کولو (MPE) په توګه څرګندیږي، لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي (۴۲).
کنګل شوي نیورون ګولۍ په یخ سړه ۸۰٪ میتانول (v/v) کې همجنسه شوې، ورټیکس شوې، او د -۲۰ درجو سانتي ګراد په تودوخه کې د ۳۰ دقیقو لپاره انکیوبیټ شوې. نمونه بیا وګرځوئ او په +۴ درجو سانتي ګراد کې د ۳۰ دقیقو لپاره وخورئ. نمونه په ۲۱،۰۰۰ ګرامه کې د ۵ دقیقو لپاره په ۴ درجو سانتي ګراد کې سینټرفیوج شوه، او بیا پایله لرونکی سوپرناټینټ د SpeedVac کانسینټریټر په کارولو سره د ۲۵ درجو سانتي ګراد په تودوخه کې راټول او وچ شو ترڅو وروسته تحلیل شي. لکه څنګه چې پورته تشریح شوي، د LC-MS تحلیل د ترتیب شوي حجرو په امینو اسیدونو کې ترسره شو. د TraceFinder (نسخه ۴.۲، Thermo Fisher Scientific) په کارولو سره، د معلوماتو تحلیل د هر مرکب د مونوسوټوپیک ماس په کارولو سره ترسره شو. د میټابولایټ ډیټا کوانټیل نورمال کول د پری پروسس کور سافټویر پیکج (۵۷) په کارولو سره ترسره شول.
د ټوټې چمتو کول. موږک په چټکۍ سره د کاربن ډای اکسایډ سره بې هوشي شو او سر یې پرې شو، دماغ یې په چټکۍ سره له کوپړۍ څخه لرې شو، او د یخ ډک وایبریټینګ چاقو (HM-650 V، ترمو فشر ساینټیفیک، والډورف، جرمني) د 300 څخه تر 375 μm ساګیټل برخو کې پرې کولو لپاره کارول شوی و. سړه کاربن ګازی کول (95٪ O2 او 5٪ CO2) ټیټ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوډیم فاسفیټ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-ګلوکوز، 1.0 mM CaCl2 او 6.0 mM MgCl2 د pH 7.4 او 310 څخه تر 330 mOsm پورې تنظیم کړئ). ترلاسه شوي دماغي ټوټې یوې داسې خونې ته انتقال کړئ چې لوړ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سوډیم فاسفیټ بفر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-ګلوکوز، 4.0 mM CaCl2 او mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 او 310 څخه تر 320 mOsm ولري. ټوټې د 20 څخه تر 30 دقیقو پورې وساتئ ترڅو د ثبت کولو دمخه بیرته راګرځول شي.
ثبت کول. د ټولو ثبتونو لپاره د مایکروسکوپ مرحله چې د ثابت ثبت کولو چیمبر او 20x اوبو ډوبولو مقصدي لینز (Scientifica) سره سمبال وه کارول شوې وه. د پورکینجي حجرې د (i) د بدن اندازې، (ii) د سیریبیلم اناتوميکي موقعیت، او (iii) د فلوروسینټ mtYFP راپور ورکوونکي جین څرګندولو لخوا پیژندل شوي. د 5 څخه تر 11 میګوهم پورې د ټیپ مقاومت سره پیچ پایپټ د بوروسیلیکیټ شیشې کیپیلري (GB150-10، 0.86 ملي میتر × 1.5 ملي میتر × 100 ملي میتر، ساینس محصولات، هوفهیم، جرمني) او افقي پایپټ وسایلو (P-1000، سوټر)، نوواټو، CA) لخوا ایستل کیږي. ټول ثبتونه د ELC-03XS npi پیچ کلیمپ امپلیفیر (npi الکترونیکي GmbH، تام، جرمني) لخوا ترسره شوي، کوم چې د سافټویر سیګنال (نسخه 6.0، کیمبرج الکترونیکي، کیمبرج، انګلستان) لخوا کنټرول شوی و. تجربه د 12.5 kHz نمونې اخیستلو نرخ کې ثبت شوې. سیګنال د دوه لنډ پاس بیسل فلټرونو سره فلټر شوی چې په ترتیب سره د 1.3 او 10 kHz کټ آف فریکونسیو سره. د غشا او پایپټ ظرفیت د امپلیفیر په کارولو سره د معاوضې سرکټ لخوا جبران کیږي. ټولې تجربې د اورکا-فلش 4.0 کیمرې (هاماماتسو، ګیرډن، جرمني) تر کنټرول لاندې ترسره شوې، کوم چې د هوکاو سافټویر (نسخه 2.8، هاماماتسو، ګیرډن، جرمني) لخوا کنټرول شوی و.
د ټول حجرو معمول ترتیب او تحلیل. د ثبت کولو دمخه سمدلاسه، پایپټ د داخلي محلول سره ډک کړئ چې لاندې مواد لري: 4.0 mM KCl، 2.0 mM NaCl، 0.2 mM EGTA، 135.0 mM پوټاشیم ګلوکونیټ، 10.0 mM هیپس، 4.0 mM ATP (Mg)، 0.5 mM ګوانوسین ټرای فاسفیټ (GTP) (Na) او 10.0 mM کریټینین فاسفیټ د pH 7.25 سره تنظیم شوي، او د اوسموټیک فشار 290 mOsm (سوکروز) و. د غشا ماتولو لپاره د 0 pA ځواک پلي کولو سمدلاسه وروسته، د آرامۍ غشا پوټینشن اندازه شو. د ننوتلو مقاومت د -40، -30، -20، او -10 pA هایپرپولرائز شوي جریانونو پلي کولو سره اندازه کیږي. د ولټاژ غبرګون شدت اندازه کړئ او د ننوتلو مقاومت محاسبه کولو لپاره د اوهم قانون وکاروئ. په ولټاژ کلیمپ کې د 5 دقیقو لپاره ناڅاپي فعالیت ثبت شو، او sPSC په ایګور پرو (نسخه 32 7.01، ویو میټریکس، لیک اوسویګو، اوریګون، امریکا) کې د نیمه اتوماتیک پیژندنې سکریپټ په کارولو سره پیژندل شوی او اندازه شوی. د IV منحنی او ثابت حالت جریان د بیټرۍ په مختلفو پوټینشیلونو (د -110 mV څخه پیل کیږي) کې د کلمپ کولو او په 5 mV مرحلو کې د ولټاژ زیاتولو سره اندازه کیږي. د AP تولید د ډیپولاریز کولو جریان پلي کولو سره ازمول شوی. د ډیپولاریز کولو جریان پلي کولو پرمهال حجره په -70 mV کې کلمپ کړئ. د هر ثبت کولو واحد د ګام اندازه په جلا توګه تنظیم کړئ (10 څخه تر 60 pA). د AP اعظمي فریکونسي په لاسي ډول د نبض سپیکونو شمیرلو سره محاسبه کړئ چې د AP لوړ فریکونسي رامینځته کوي. د AP حد د ډیپولاریز کولو نبض دوهم مشتق په کارولو سره تحلیل کیږي چې لومړی یو یا ډیر APs رامینځته کوي.
د سوراخ شوي پیچ ترتیب او تحلیل. د معیاري پروتوکولونو په کارولو سره د سوراخ شوي پیچ ثبت کول ترسره کړئ. د ATP- او GTP څخه پاک پایپټ وکاروئ چې لاندې اجزا پکې نه وي: 128 mM ګلوکونیټ K، 10 mM KCl، 10 mM هیپس، 0.1 mM EGTA او 2 mM MgCl2، او pH 7.2 سره تنظیم کړئ (د KOH په کارولو سره). ATP او GTP د حجرو د غشا د غیر کنټرول شوي نفوذ مخه نیولو لپاره د انټراسیلولر محلول څخه ایستل شوي دي. د پیچ ​​پایپټ د امفوټیریسین لرونکي داخلي محلول (تقریبا 200 څخه تر 250μg/ml؛ G4888، سیګما-الډریچ) سره ډک شوی ترڅو د پنچ شوي پیچ ریکارډ ترلاسه کړي. امفوټیریسین په ډایمیتیل سلفوکسایډ کې حل شوی و (وروستی غلظت: 0.1 څخه تر 0.3٪؛ DMSO؛ D8418، سیګما-الډریچ). د کارول شوي DMSO غلظت په مطالعه شوي نیورونونو باندې د پام وړ اغیزه نه درلوده. د پنچ کولو پروسې په جریان کې، د چینل مقاومت (Ra) په دوامداره توګه څارل کیده، او تجربه د Ra او AP د ثبات (20-40 دقیقو) د طول البلد وروسته پیل شوه. په خپلسري ډول فعالیت د 2 څخه تر 5 دقیقو لپاره په ولټاژ او/یا اوسني کلیمپ کې اندازه کیږي. د معلوماتو تحلیل د ایګور پرو (نسخه 7.05.2، ویو میټریکس، امریکا)، ایکسل (نسخه 2010، مایکروسافټ کارپوریشن، ریډمونډ، امریکا) او ګراف پیډ پریزم (نسخه 8.1.2، ګراف پیډ سافټویر انکارپوریشن، لا جولا، CA) په کارولو سره ترسره شو. د ناڅاپي APs پیژندلو لپاره، د ایګور پرو نیورو میټیک v3.0c پلگ ان کارول کیږي. د ورکړل شوي حد په کارولو سره په اتوماتيک ډول APs وپیژنئ، کوم چې د هر ریکارډ لپاره په انفرادي ډول تنظیم شوی. د سپیک وقفې په کارولو سره، د سپیک فریکونسي د اعظمي فوري سپیک فریکونسي او اوسط سپیک فریکونسي سره وټاکئ.
د PN جلا کول. د مخکې خپاره شوي پروتوکول سره په تطابق سره، PNs د موږک سیریبیلم څخه په یوه ټاکلي مرحله کې پاک شوي (58). په لنډه توګه، سیریبیلم د یخ یخ جلا کولو په وسیله کې [د HBSS Ca2+ او Mg2+ پرته، د 20 mM ګلوکوز، پنسلین (50 U/ml) او سټریپټومیسین (0.05 mg/ml) سره ضمیمه شوی]، او بیا میډیم په پاپین کې هضم شوی [HBSS، د 1-سیسټین·HCl (1 mg/ml)، پاپین (16 U/ml) او ډیوکسیریبونوکلیز I (DNase I; 0.1 mg/ml) سره ضمیمه شوی] د 30 دقیقو لپاره په 30 درجو سانتی ګراد کې درملنه وکړئ. لومړی نسجونه په HBSS میډیم کې چې د هګۍ بلغم (10 mg/ml)، BSA (10 mg/ml) او DNase (0.1 mg/ml) لري د خونې په تودوخه کې ومینځئ ترڅو د انزایمیک هضم مخه ونیسئ، او بیا په HBSS میډیم کې چې 20 mM ګلوکوز لري په HBSS کې په نرمۍ سره پیس کړئ، پنسلین (50 U/ml)، سټریپټومیسین (0.05 mg/ml) او DNase (0.1 mg/ml) واحد حجرات خوشې کړئ. پایله لرونکی حجروي تعلیق د 70μm حجروي سټرینر له لارې فلټر شو، بیا حجرات د سینټرفیوګیشن (1110 rpm، 5 دقیقې، 4°C) لخوا پیلیټ شول او په ترتیب کولو میډیم کې بیا ځړول شول [HBSS، د 20 mM ګلوکوز، 20٪ د جنین غواګانو سره ضمیمه شوی) سیرم، پنسلین (50 U/ml) او سټریپټومیسین (0.05 mg/ml)]؛ د پروپیډیم آیوډایډ سره د حجرو د ژوند وړتیا ارزونه وکړئ او د حجرو کثافت 1×106 څخه تر 2×106 حجرو/ml پورې تنظیم کړئ. د جریان سایټومیټري څخه دمخه، تعلیق د 50 μm حجرو سټرینر له لارې فلټر شوی و.
د جریان سایټومیټر. د حجرو ترتیب کول د FACSAria III ماشین (BD بایوسینسز) او FACSDiva سافټویر (BD بایوسینسز، نسخه 8.0.1) په کارولو سره په 4 درجو سانتی ګراد کې ترسره شول. د حجرو تعلیق د 100 μm نوزل ​​په کارولو سره د 20 psi فشار لاندې د ~2800 پیښو/ثانیې په نرخ ترتیب شو. څرنګه چې دودیز ګیټینګ معیارونه (د حجرو اندازه، بایموډل توپیر، او د توزیع ځانګړتیاوې) نشي کولی د نورو حجرو ډولونو څخه د PN سم جلا کول تضمین کړي، د ګیټینګ ستراتیژي د mitoYFP+ ​​او کنټرول mitoYFP - موږکانو کې د YFP شدت او آټو فلوروسینس مستقیم پرتله کولو پراساس تنظیم شوې. YFP د 488 nm لیزر لاین سره د نمونې د شعاع کولو له لارې هڅول کیږي، او سیګنال د 530/30 nm بینډ پاس فلټر په کارولو سره کشف کیږي. په mitoYFP+ ​​موږکانو کې، د Rosa26-mitoYFP راپور ورکوونکي جین نسبي ځواک هم د نیورونال بدن او اکسون ټوټې توپیر کولو لپاره کارول کیږي. ۷-AAD د ۵۶۱ nm ژیړ لیزر سره هڅول کیږي او د ۶۷۵/۲۰ nm بینډ پاس فلټر سره کشف کیږي ترڅو مړه حجرات خارج کړي. په ورته وخت کې د اسټروسایټونو جلا کولو لپاره، د حجرو تعلیق د ACSA-2-APC سره رنګ شوی و، بیا نمونه د ۶۴۰ nm لیزر لاین سره شعاع شوې وه، او د سیګنال کشف کولو لپاره د ۶۶۰/۲۰ nm بینډ پاس فلټر کارول شوی و.
راټول شوي حجرات د سینټرفیوګیشن (۱۱۱۰ rpm، ۵ دقیقې، ۴°C) په واسطه ګولۍ شوي او تر کارولو پورې په -۸۰°C کې زیرمه شوي. Mfn2cKO موږکان او د دوی د تسکرو بچیان په ورته ورځ طبقه بندي شوي ترڅو د طرزالعمل بدلون کم کړي. د FACS معلوماتو وړاندې کول او تحلیل د FlowJo سافټویر (FlowJo LLC، اشلینډ، اوریګون، امریکا) په کارولو سره ترسره شوي.
لکه څنګه چې پورته یادونه وشوه (59)، د ریښتیني وخت PCR د ترتیب شوي نیورونونو څخه د DNA جلا کولو لپاره کارول کیږي ترڅو د mtDNA وروسته مقدار ټاکلو لپاره. د خطي والي او حد حساسیت په پیل کې د qPCR په مختلفو شمیر حجرو باندې چلولو سره ازمول شوی و. په لنډه توګه، 300 PN په یوه لیسیز بفر کې راټول کړئ چې 50 mM tris-HCl (pH 8.5)، 1 mM EDTA، 0.5٪ Tween 20 او proteinase K (200 ng/ml) لري او په 55°C 120 دقیقو کې انکیوبیټ کړئ. حجرې د 10 دقیقو لپاره په 95°C کې نور انکیوبیټ شوي ترڅو د پروټینیز K بشپړ غیر فعال کول ډاډمن کړي. د mt-Nd1 لپاره ځانګړي TaqMan پروب (ترمو فشر) په کارولو سره، mtDNA د 7900HT ریښتیني وخت PCR سیسټم (ترمو فشر ساینسي) کې د نیمه کمیتي PCR لخوا اندازه شو. ساینس، د کتلاګ شمیره Mm04225274_s1)، mt-Nd6 (د ترمو فشر ساینسيف، د کتلاګ شمیره AIVI3E8) او 18S (د ترمو فشر ساینسيف، د کتلاګ شمیره Hs99999901_s1) جینونه.
د پروټوم نمونې چمتو کول. د محلول په تودوخه کې د 10 دقیقو لپاره په 95 درجو سانتي ګراد کې د 10 دقیقو لپاره او سونیک کولو سره، د لیسیز بفر کې [6 M ګوانایډین کلورایډ، 10 mM ټریس (2-کاربوکسیتیل) فاسفین هایدروکلورایډ، 10 mM کلورواسیټامایډ او 100 mM ټریس- په HCl کې د لیز منجمد نیورون ګولۍ]. د 10 دقیقو لپاره په بایورپټر (ډیاګینوډ) کې (30 ثانیې نبض / 30 ثانیې وقفه موده). نمونه په 20 mM ټریس-HCl (pH 8.0) کې 1:10 حل شوه، د 300 ng ټریپسین سرو زرو (پرومیګا) سره مخلوط شوه، او د بشپړ هضم ترلاسه کولو لپاره د شپې په 37 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ شوه. په دویمه ورځ، نمونه د 20 دقیقو لپاره په 20,000 ګرامه کې سینټرفیوج شوه. سوپرنټینټ د 0.1٪ فارمیک اسید سره حل شو، او محلول د ځان جوړ شوي سټیج ټیپونو سره پاک شو. نمونه په SpeedVac وسیله (Eppendorf concentrator plus 5305) کې په 45 درجو سانتي ګراد کې وچه شوه، او بیا پیپټایډ په 0.1٪ فارمیک اسید کې وځنډول شو. ټولې نمونې په ورته وخت کې د ورته کس لخوا چمتو شوې. د اسټروسایټ نمونو تحلیل کولو لپاره، 4 μg ډیسالټ شوي پیپټایډونه د ټنډم ماس ټګ (TMT10plex، د کتلاګ شمیره 90110، Thermo Fisher Scientific) سره د پیپټایډ څخه TMT ریجنټ تناسب 1:20 سره لیبل شوي. د TMT لیبل کولو لپاره، 0.8 ملی ګرامه TMT ریجنټ د 70 μl انهایډروس ACN کې بیا وځنډول شو، او وچ شوی پیپټایډ د 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) په 9 μl کې بیا جوړ شو، کوم چې په ACN کې د TMT ریجنټ 7 μl اضافه شو. غلظت 43.75٪ و. د 60 دقیقو انکیوبیشن وروسته، عکس العمل د 2 μl 5٪ هایدروکسیلامین سره قانع شو. لیبل شوي پیپټایډونه راټول شوي، وچ شوي، د 0.1٪ فارمیک اسید (FA) په 200μl کې بیا ځړول شوي، په دوو برخو ویشل شوي، او بیا د ځان جوړ شوي سټیج ټیپونو په کارولو سره پاک شوي. د الټی میټ 3000 الټرا لوړ فعالیت مایع کروماتګراف (الټی میټ 3000 الټرا لوړ فعالیت مایع کروماتګراف) په کارولو سره، د دوو نیمو څخه یو یې د 1mm x 150mm اکویټي کروماتګرافیک کالم کې ټوټه ټوټه شوی و چې د 130Å1.7μm C18 ذراتو څخه ډک شوی و (اوبه، کتلاګ نمبر SKU: 186006935). ترمو فشر ساینسي). پیپټایډونه د 30μl/min په جریان کې جلا کړئ، د 1٪ څخه تر 50٪ بفر B څخه د 85 دقیقو لپاره د 96 دقیقو د ګام په ګام تدریجي سره جلا کړئ، له 50٪ څخه تر 95٪ بفر B څخه د 3 دقیقو لپاره، بیا د 95٪ بفر B لپاره 8 دقیقې؛ بفر A 5% ACN او 10 mM امونیم بای کاربونیټ (ABC) دی، او بفر B 80% ACN او 10 mM ABC دی. په هرو 3 دقیقو کې کسرونه راټول کړئ او په دوه ډلو (1 + 17، 2 + 18، او نور) کې یې سره یوځای کړئ او په ویکیوم سنټرفیوج کې یې وچ کړئ.
د LC-MS/MS تحلیل. د ډله ایز سپیکٹرومیټري لپاره، پیپټایډونه (شمیره r119.aq) د 25 سانتي مترو، 75 μm داخلي قطر PicoFrit تحلیلي کالم (نوی هدف لینز، د برخې شمیره PF7508250) کې جلا شوي وو چې د 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ میډیم (ډاکټر مایش، میټ) سره سمبال شوي وو، EASY-nLC 1200 وکاروئ (ترمو فشر ساینسي، جرمني). کالم په 50 درجو سانتي ګراد کې ساتل شوی و. بفرونه A او B په ترتیب سره په اوبو کې 0.1٪ فارمیک اسید او په 80٪ ACN کې 0.1٪ فارمیک اسید دي. پیپټایډونه د 65 دقیقو لپاره له 6٪ څخه تر 31٪ بفر B څخه او د 31٪ څخه تر 50٪ بفر B څخه د 5 دقیقو لپاره د 200 nl/min تدریجي سره جلا شوي وو. ایلوټ شوي پیپټایډونه په اوربیټریپ فیوژن ماس سپیکٹرومیټر (ترمو فشر ساینټیفیک) کې تحلیل شوي. د پیپټایډ مخکیني m/z اندازه کول د 350 څخه تر 1500 m/z پورې د 120,000 ریزولوشن سره ترسره کیږي. د 27٪ نورمال شوي ټکر انرژي په کارولو سره، د 2 څخه تر 6 پورې د چارج حالت سره ترټولو قوي مخکیني د لوړ انرژي C ټریپ ډیسوسی ایشن (HCD) کلیویج لپاره غوره کیږي. د دورې وخت 1 ثانیو ته ټاکل شوی. د پیپټایډ ټوټې m/z ارزښت د 5 × 104 د کوچني AGC هدف او د 86 ms اعظمي انجیکشن وخت په کارولو سره په ایون ټریپ کې اندازه شوی. د ټوټې کیدو وروسته، مخکیني د 45 ثانیو لپاره د متحرک اخراج لیست کې ځای په ځای شوی و. د TMT لیبل شوي پیپټایډونه د 50 سانتي مترو، 75 μm اکلیم پیپ میپ کالم (ترمو فشر ساینټیفیک، د کتلاګ شمیره 164942) کې جلا شوي، او د مهاجرت سپیکٹرا د اوربیټراپ لوموس ټریبریډ ماس سپیکٹرومیټر (ترمو فشر ساینټیفیک) کې تحلیل شوي چې د لوړ ساحې غیر متناسب څپې شکل ایونونو (FAIMS) تجهیزاتو (ترمو فشر ساینټیفیک) سره سمبال شوي د −50 او −70 V په دوه معاوضې ولټاژونو کې کار کوي. د همغږي کولو مخکیني پراساس غوره شوی MS3 د TMT راپور ایون سیګنال اندازه کولو لپاره کارول کیږي. د پیپټایډ جلا کول په EASY-nLC 1200 کې ترسره شوي، د 90٪ خطي ګریډینټ ایلیوشن په کارولو سره، د 6٪ څخه تر 31٪ پورې د بفر غلظت سره؛ بفر A 0.1٪ FA و، او بفر B 0.1٪ FA او 80٪ ACN و. تحلیلي کالم په 50 ° C کې چلول کیږي. د FAIMS د معاوضې ولټاژ سره سم د اصلي فایل ویشلو لپاره د فری سټایل (نسخه 1.6، ترمو فشر ساینټیفیک) وکاروئ.
د پروټین پیژندنه او اندازه کول. د مدغم انډرومیډا لټون انجن په کارولو سره، اصلي معلومات د MaxQuant نسخه 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) په کارولو سره تحلیل شوي. د Aequorea victoria څخه ترلاسه شوي Cre recombinase او YFP ترتیبونو سربیره، د پیپټایډ ټوټې سپیکٹرا د موږک حوالې پروټوم (Proteome ID UP000000589، د می په 2017 کې د UniProt څخه ډاونلوډ شوی) د کینونیکي ترتیب او isoform ترتیب لپاره پلټل شوي. میتیونین اکسیډیشن او پروټین N-ټرمینل اسټیلیشن د متغیر تعدیلاتو په توګه تنظیم شوي؛ د سیستین کاربامویل میتیلیشن د ثابت تعدیلاتو په توګه تنظیم شوی. د هاضمې پیرامیټرونه "ځانګړتیا" او "ټریپسین/P" ته ټاکل شوي. د پروټین پیژندنې لپاره کارول شوي پیپټایډونو او ریزر پیپټایډونو لږترلږه شمیر 1 دی؛ د ځانګړي پیپټایډونو لږترلږه شمیر 0 دی. د پیپټایډ نقشې میچ کولو شرایطو لاندې، د پروټین پیژندنې کچه 0.01 وه. د "دوهم پیپټایډ" اختیار فعال شوی. د مختلفو اصلي فایلونو ترمنځ د بریالي پیژندنې لیږدولو لپاره د "رنزونو ترمنځ میچ" اختیار وکاروئ. د لیبل فری کوانټیفیکیشن (LFQ) (60) لپاره د LFQ لږترلږه تناسب شمیره 1 وکاروئ. د LFQ شدت په هر وخت کې لږترلږه په یوه جینټایپ ګروپ کې لږترلږه دوه معتبر ارزښتونو لپاره فلټر شوی، او د 0.3 عرض سره د نورمال ویش څخه استخراج کیږي او 1.8 ښکته حرکت کوي. د LFQ پایلو تحلیل لپاره د پرسیوس کمپیوټري پلیټ فارم (https://maxquant.net/perseus/) او R (https://r-project.org/) وکاروئ. د لیما سافټویر کڅوړې څخه دوه اړخیزه معتدل t ازموینه د توپیري څرګندونې تحلیل لپاره کارول شوې وه (61). د اکتشافي معلوماتو تحلیل د ggplot، FactoMineR، factoextra، GGally او phetmap په کارولو سره ترسره کیږي. د TMT پر بنسټ پروټومیکس ډیټا د MaxQuant نسخه 1.6.10.43 په کارولو سره تحلیل شوې. د یونی پروټ د انساني پروټومکس ډیټابیس څخه د خامو پروټومکس ډیټا لټون وکړئ، کوم چې د سپتمبر په 2018 کې ډاونلوډ شوی و. تحلیل کې د جوړونکي لخوا چمتو شوي د آاسوټوپ پاکوالي اصلاح فاکتور شامل دی. د توپیر بیان تحلیل لپاره په R کې لیما وکاروئ. اصلي معلومات، د ډیټابیس لټون پایلې، او د معلوماتو تحلیل کاري فلو او پایلې ټول د PRIDE ملګري ذخیره له لارې د ډیټا سیټ پیژندونکي PXD019690 سره د پروټوم ایکس چینج اتحاد کې زیرمه شوي.
د فعالیت تشریحات تحلیل بډایه کوي. د انجینیوټي پاتھ وے تحلیل (QIAGEN) وسیله د 8 اونیو په اوږدو کې د ډیټا سیټ د فعال تشریح اصطلاحاتو بډایه کولو لپاره کارول شوې وه (شکل 1). په لنډه توګه، د LC-MS/MS (ټنډم ماس سپیکٹرومیټري) ډیټا تحلیل څخه ترلاسه شوي کمیتي پروټین لیست د لاندې فلټر معیارونو سره کارول کیږي: د عضلاتو عضلات د ډولونو او شالید په توګه غوره شوي، او کټګوري ښیې چې د بنجامیني لخوا د 0.05 یا ټیټ بډایه کولو لپاره تنظیم شوی P ارزښت د پام وړ ګڼل کیږي. د دې ګراف لپاره، د تنظیم شوي P ارزښت پراساس په هر کلستر کې پنځه غوره اضافي کټګورۍ ښودل شوي. د ډیری t-ټیسټ په کارولو سره، د بنجامیني، کریګر، او یکوټیلي (Q = 5٪) د دوه مرحلو خطي بوسټ پروګرام په کارولو سره، د وخت کورس پروټین څرګندونې تحلیل په هره کټګورۍ کې پیژندل شوي مهم نوماندانو باندې ترسره کیږي، او هر قطار په جلا توګه تحلیل کیږي. د یو ثابت SD غوره کولو ته اړتیا نشته.
د دې مطالعې پایلې د خپرو شویو ډیټابیسونو سره پرتله کولو او په شکل 1 کې د وین ډیاګرام رامینځته کولو لپاره، موږ د کمیتي پروټین لیست د میتو کارټا 2.0 تشریحاتو سره یوځای کړ (24). د ډیاګرام رامینځته کولو لپاره د آنلاین وسیلې ډرا وین ډیاګرام (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) څخه کار واخلئ.
د پروټومیک تحلیل لپاره کارول شوي احصایوي پروسیجرونو په اړه د تفصيلي معلوماتو لپاره، مهرباني وکړئ د موادو او میتودونو اړونده برخې ته مراجعه وکړئ. د نورو ټولو تجربو لپاره، تفصيلي معلومات په اړونده افسانه کې موندل کیدی شي. پرته لدې چې بل ډول مشخص شي، ټول معلومات د اوسط ± SEM په توګه څرګند شوي، او ټول احصایوي تحلیلونه د ګراف پیډ پریزم 8.1.2 سافټویر په کارولو سره ترسره شوي.
د دې مقالې لپاره د اضافي موادو لپاره، مهرباني وکړئ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 وګورئ
دا یوه خلاصه لاسرسی لرونکې مقاله ده چې د کریټیو کامنز انتساب-غیر-تجارتي جواز شرایطو لاندې ویشل شوې ده، کوم چې په هر ډول رسنۍ کې د کارولو، ویشلو او تکثیر اجازه ورکوي، تر هغه چې وروستۍ کارول د سوداګریزې ګټې لپاره نه وي او اساس دا وي چې اصلي کار سم دی. حواله.
یادونه: موږ یوازې له تاسو څخه غوښتنه کوو چې خپل د برېښنالیک پته ورکړئ ترڅو هغه کس چې تاسو یې پاڼې ته وړاندیز کوئ پوه شي چې تاسو غواړئ چې دوی برېښنالیک وګوري او دا سپیم نه دی. موږ به هیڅ برېښنالیک پته ونه نیسو.
دا پوښتنه د دې لپاره کارول کیږي چې تاسو لیدونکي یاست او د اتوماتیک سپیم سپارلو مخه ونیسئ.
E. Motori، I. Atanassov، SMV Kochan، K. Folz-Donahue، V. Sakthivelu، P. Giavalisco، N. Toni، J. Puyal، N.G. لارسن
د غیر فعال نیورونونو د پروټومکس تحلیل څرګنده کړه چې میټابولیک پروګرامونه د نیوروډیجنریشن سره د مبارزې لپاره فعال شوي دي.
E. Motori، I. Atanassov، SMV Kochan، K. Folz-Donahue، V. Sakthivelu، P. Giavalisco، N. Toni، J. Puyal، N.G. لارسن
د غیر فعال نیورونونو د پروټومکس تحلیل څرګنده کړه چې میټابولیک پروګرامونه د نیوروډیجنریشن سره د مبارزې لپاره فعال شوي دي.
© 2020 د ساینس د پرمختګ لپاره امریکایی ټولنه. ټول حقونه خوندي دي. AAAS د HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef او COUNTER شریک دی. ساینس پرمختګ ISSN 2375-2548.