اوسنی†اوسنی پته: OX11 0DE، انګلستان، د الماس ودانۍ، د هارویل ساینس او ​​نوښت پارک، ډایټ کوټ، اکسفورډشایر، انګلستان، د الماس رڼا سرچینې شرکت، لمیټډ، د بریښنایی بیولوژیکي عکس اخیستنې مرکز.
د عکس العمل مرکز د رڼا راټولولو کمپلیکس ۱ (RC-LH1) د ارغواني فوتوټروفیک باکتریا اصلي فوتوسنتیک برخه ده. موږ د Rhodopseudomonas palustris څخه د RC-LH1 کمپلیکس دوه کریو-الیکټرون مایکروسکوپي جوړښتونه معرفي کړل. د RC-LH114-W کمپلیکس 2.65-Å ریزولوشن جوړښت د RC شاوخوا 14 فرعي واحد LH1 لوپونه لري، کوم چې د پروټین W لخوا مداخله کیږي، پداسې حال کې چې د پروټین-W پرته کمپلیکس په بشپړ ډول د RC لخوا محاصره شوی RC جوړښت دی. تړل شوی 16 فرعي واحد LH1 لوپ. د دې جوړښتونو پرتله کول په RC-LH1 کمپلیکس کې د کوینون متحرکاتو ته بصیرت چمتو کوي، پشمول د RC QB سایټ کې د کوینون تړلو پرمهال د پخوانیو نا ټاکل شوي جوړښتي بدلونونو، او همدارنګه د مرستندویه کوینون تړلو سایټونو موقعیت، کوم چې دوی RC ته لیږدولو کې مرسته کوي. د W پروټین ځانګړی جوړښت د LH1 لوپ د بندیدو مخه نیسي، په دې توګه د کوینون/کوینولون تبادلې ګړندي کولو لپاره یو چینل رامینځته کوي.
هغه انرژي چې د فوتوسنتز لخوا چمتو کیږي کولی شي په ځمکه کې تقریبا ټول ژوند وساتي، او دا د لمریزې بایو ټیکنالوژۍ لپاره لوی ظرفیت لري. پداسې حال کې چې نړیوال فوتوسنتز ته وده ورکوي، ارغواني فوتوټروفیک باکتریا د انرژۍ مختلف طریقې او میټابولیک وړتیاوې هم ښیې. دوی کولی شي د فوتوسنتز څخه مخنیوی وکړي او په تیاره کې د هیټروټروفیک باکتریا په توګه وده وکړي، کولی شي نایتروجن او کاربن ډای اکسایډ تنظیم کړي، هایدروجن تولید کړي، او اروماتیک مرکبات خراب کړي (1-3). د دې پروسو لپاره انرژي چمتو کولو لپاره، رڼا باید په چټکۍ او مؤثره توګه کیمیاوي انرژۍ ته واړول شي. دا پروسه هغه وخت پیل کیږي کله چې د رڼا بندولو انټینا کمپلیکس رڼا جذبوي او بنده شوې انرژي د عکس العمل مرکز (RC) ته لیږدوي، په دې توګه د چارج جلا کول پیل کوي (4 - 7). په ارغواني فوتوټروفیک باکتریا کې د فوتوسنتز بنسټیز واحد د 2 ډول RC څخه جوړ شوی دی، د رڼا راټولولو کمپلیکس 1 (LH1) لخوا محاصره شوی، د RC-LH1 اصلي کمپلیکس جوړوي. LH1 د منحني αβ هیټروډیمرونو د یوې لړۍ لخوا رامینځته شوی، چې هر یو یې دوه باکتریا کلوروفیل (BChl) مالیکولونه او یو یا دوه کیروټینایډونه (8-12) سره تړلي دي. تر ټولو ساده LH1 انتن د 16 یا 17 αβ هیټروډیمرونو څخه جوړ دی چې RC (9-13) په یوه تړلي لوپ کې محاصره کوي، مګر په نورو اصلي کمپلیکسونو کې، ټرانس میمبرین پیپټایډونه د شاوخوا LH1 تسلسل مداخله کوي، په دې توګه د RC او سایټوکروم bc1 کمپلیکس (11، 13-15) ترمنځ د کوینول/کوینون خپریدو ته وده ورکوي. ارغواني فوټوټروفیک نبات روډوپسوډوموناس (Rps.) یو ماډل ارګانیزم دی چې کولی شي د انرژي او الکترون لیږد درک کړي چې د فوتوسنتز ملاتړ کوي. د Rps لومړی کرسټال جوړښت. د پالستریس RC-LH1 کمپلیکس ماډل RC دی، چې د 15 هیټروډیمیریک LH1 لوپونو لخوا محاصره شوی، کوم چې د "پروټین W" په نوم د نامعلوم پروټین لخوا مداخله کیږي (14). پروټین-W وروسته د RPA4402 په توګه وپیژندل شو، کوم چې یو غیر مشخص 10.5kDa پروټین دی چې درې وړاندوینې شوي ټرانس میمبرین هیلیسونه (TMH) (16) لري. موږ وړاندیز کوو چې د rpa4402 جین کوډ کولو پروټین W نوم pufW ته بدل کړو ترڅو د RC-L، M (pufL، pufM) او LH1α، β (pufA، pufB) فرعي واحدونو کوډ کولو جینونو لپاره کارول شوي نومونې سره مطابقت ولري. په زړه پورې خبره دا ده چې پروټین-W یوازې د RC-LH1 شاوخوا 10٪ کې شتون لري، چې Rps څرګندوي. palustris دوه مختلف RC-LH1 کمپلیکسونه تولیدوي. دلته، موږ د دوه اصلي کمپلیکسونو لوړ ریزولوشن کریو-EM (کریو-EM) جوړښتونو راپور ورکوو، یو د پروټین W او 14 αβ هیټروډیمرونو سره، بل د پروټین W پرته او د تړل شوي 16 هیټروډیمر LH1 لوپ پرته. زموږ جوړښت د Rps. palustris د RC-LH1 کمپلیکس په پوهیدو کې د ګام بدلون استازیتوب کوي، ځکه چې موږ د هر ډول همجنس نفوس تحلیل کړی او کافي ریزولوشن لرو چې په روښانه توګه هر پیپټایډ او تړلي رنګونه او اړونده لیپیدونه او کوینونونه وټاکو. د دې جوړښتونو پرتله کول ښیي چې درې TMH پروټینونه-W چې تر دې دمه په کوم بل RC-LH1 کمپلیکس کې ندي موندل شوي د کوینون / کوینولون تبادلې ګړندي کولو لپاره د کوینون چینل تولیدوي. د لیپید او کوینون تړلو یو شمیر ساتل شوي ځایونه پیژندل شوي، او موږ د کوینون او RC ترکیب وروسته یو نوی جوړښتي بدلون څرګند کړی، کوم چې ممکن د اکسیجن شوي فوټوټروفیک ارګانیزمونو د فوتوسیسټم II (PSII) RC لپاره مناسب وي. زموږ موندنې د ارغواني فوټوټروفیک باکتریا د RC-LH1 اصلي کمپلیکس کې د کوینون / کوینولون تړلو او تبادلې کینیټکس کې نوي بصیرتونه چمتو کوي.
د Rps. palustris کې موندل شوي دوه کمپلیکسونو تفصيلي مطالعې اسانه کولو لپاره، موږ هر RC-LH1 د بایو کیمیکل میتودونو له لارې جلا کوو. د پروټین W-کمښت کمپلیکس (له دې وروسته د ΔpufW په نوم یادیږي) د pufW جین نشتوالي څخه پاک شوی و (16)، او یوازې یو RC-LH1 کمپلیکس تولید کیدی شي. د پروټین W-مرکب کمپلیکس د یو سټرین لخوا تولید کیږي. د دې سټرین پروټین W د C-ټرمینس کې د 10x His ټګ سره تعدیل شوی، ترڅو د پروټین W-مرکب کمپلیکس په مؤثره توګه د فلزاتو د غیر متحرک کولو له لارې د ډیری کموالي پروټین W سره یوځای شي. کمپلیکس په مؤثره توګه جلا شوی (16) افیونټي کروماتګرافي (IMAC).
لکه څنګه چې په شکل ۱ کې ښودل شوي، دواړه کمپلیکسونه درې فرعي واحدونه RC (RC-L، RC-M او RC-H) لري چې د LH1 انتن لخوا محاصره شوي دي. د پروټین-W نشتوالي کمپلیکس 2.80-A جوړښت 16 αβ هیټروډیمرونه ښیې، چې د RC شاوخوا په بشپړ ډول تړل شوی LH1 لوپ جوړوي، چې له دې وروسته د RC-LH116 کمپلیکس په نوم یادیږي. د پروټین-W لرونکي کمپلیکس 2.65Å جوړښت د 14-هیټروډیمر LH1 لري چې د پروټین-W لخوا مداخله کیږي، چې له دې وروسته د RC-LH114-W په نوم یادیږي.
(A او B) د مرکب سطحي استازیتوب. (C او D) تړل شوي رنګونه چې په راډونو کې څرګند شوي. (E او F) د سایټوپلازمیک سطحې څخه لیدل شوي کمپلیکسونه پیپټایډونه او LH1 فرعي واحدونه لري چې په کارټونونو کې ښودل شوي، او د پروټین-W تشې څخه د ساعت په لور شمیرل کیږي [د Rba شمیرنې سره مطابقت لري. sphaeroides complex (13)]. د LH1-α لپاره، د پروټین فرعي واحد رنګ ژیړ دی؛ د LH1-β لپاره، د پروټین فرعي واحد رنګ نیلي دی؛ د پروټین-W لپاره، پروټین سور دی؛ د RC-H لپاره، دا سیان دی؛ د RC-L لپاره، دا نارنجي دی؛ د RC-M لپاره، میجنټا. کوفیکٹرونه د راډونو لخوا ښودل شوي، شنه د BChl او BPh a مالیکولونو استازیتوب کوي، ارغواني د کیروټینایډونو استازیتوب کوي، او ژیړ د UQ10 مالیکولونو استازیتوب کوي. (G او H) د RC-LH114-W کمپلیکس (G) او RC-LH116 کمپلیکس (H) مساوي سیمه کې د پروټین-W تشې پراخه لید. کوفیکٹرونه د ځای ډکولو په بڼه ښودل کیږي، چیلیټ شوی کوینون په نیلي رنګ کې ښودل کیږي. د پروټین-W تشه په (G) کې د نیلي ډیش شوي کرښې لخوا روښانه شوې، او هغه کوچني سوري چیرې چې کوینون/کوینولول په LH116 حلقه کې خپریږي د (H) کې د تور ډیش شوي کرښې لخوا روښانه شوي.
شکل ۱ (A او B) د RC ښکارندوی کوي چې د LH1αβ هیټروډیمرونو د خلاص یا تړلو صفونو لخوا محاصره شوی، چې هر یو یې دوه BChl او یو کیروټینایډ سره نښلوي (شکل ۱، C او D). پخوانیو مطالعاتو ښودلې چې Rps د LH1 کمپلیکس دی. د سپیرولینا ژانتین په بایوسینتیک لاره کې، دا ډولونه د کیروټینایډونو مخلوط نفوس لري (۱۷). په هرصورت، سپیروپیروکسانتین غالب کیروټینایډ دی او د هغې کثافت د قناعت وړ دی. له همدې امله، موږ غوره کړه چې په ټولو LH1 تړلو ځایونو کې د سپیروکسانتین ماډل وکړو. الفا او بیټا پولیپپټایډونه واحد TMHs دي چې لنډ غشا بهرنۍ سیمې لري (شکل ۱، A، B، E، او F). که څه هم په C-ټرمینس کې د 17 پاتې شونو کثافت نه دی لیدل شوی، الفا پولیپپټایډ په دواړو کمپلیکسونو کې د Met1 څخه Ala46 ته ویشل شوی و. په RC-LH116 کې β پولیپټایډ له Gly4 څخه Tyr52 ته او په RC-LH114-W کې له Ser5 څخه Tyr52 ته راټیټ شو. د 3 یا 4 N-ټرمینل یا 13 C-ټرمینل پاتې شونو کثافت نه دی لیدل شوی (شکل S1). د وحشي ډوله فشار څخه چمتو شوي مخلوط RC-LH1 کمپلیکس د ډله ایز سپیکٹرومیټري تحلیل ښودلې چې ورک شوی سیمه د دې پیپټایډونو د هیټرولوګس تخریب پایله وه (شکل S1 او S2). د α-Met1 د N-ټرمینل فورمولیشن هم لیدل شوی (f). تحلیل ښودلې چې α-پیپټایډ د fMet1 څخه Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 پورې پاتې شونو څخه جوړ دی، او β-پیپټایډ د Ser2 څخه Ala53 پورې پاتې شونو څخه جوړ دی، کوم چې د ټیټ تودوخې EM کثافت نقشې سره ښه موافق دی.
د α-His29 او β-His36 همغږي BChls مخامخ کوي؛ هر αβ هیتروډیمر د خپلو ګاونډیو سره راټولیږي ترڅو د RC شاوخوا خلاص لوپ (RC-LH114-W) یا تړل شوی لوپ (RC-LH116) جوړ کړي. د اکسیټون سره یوځای شوي رنګ صف (شکل 1، C او D). د RC-LH114-W د 877 nm بینډ سره پرتله کول، د RC-LH116 د 880 nm جذب سور بدلون 3 nm دی (شکل 2A). په هرصورت، د ګرد ډیکروزم سپیکٹرم تقریبا ورته دی (شکل 2B)، دا په ګوته کوي چې که څه هم د خلاص او تړل شوي لوپونو ترمنځ روښانه توپیر شتون لري، د BChls سیمه ایز چاپیریال خورا ورته دی. د جذب سور بدلون ممکن د کم شوي حرارتي حرکت او په تړل شوي لوپ کې د ثبات زیاتوالي پایله وي (18، 19)، د تړل شوي لوپ له امله د رنګ ترکیب کې بدلون (20، 21)، یا د دې دوو اغیزو ترکیب (11).
(الف) د الټرا وایلیټ/لیدونکې/نږدې انفراریډ جذب طیف، چې څوکې یې د دوی اړوند رنګونو سره نښه شوي او د 775 nm په BPh چوکۍ کې نورمال شوي دي. (ب) د ګرد ډیکرویزم طیف چې د 805 nm په BChl جذب ته نورمال شوی دی. (ج او ج) د RC-LH114-W کمپلیکس (ج) او RC-LH116 کمپلیکس (ج) د وخت حل شوي جذب طیف څخه غوره شوی ΔA سپیکٹرا. د ښه پرتله کولو لپاره، ټول سپیکٹرا په 0.2 ps کې د ∆A ∆A ته نورمال شوي دي. (ج) د UQ2 د مختلفو غلظتونو په شتون کې د وړانګو وروسته د سایټوکروم c2 اکسیډیشن کچه (د خام معلوماتو لپاره شکل S8 وګورئ). (ف) په هغو حجرو کې چې د ټیټ، منځني یا لوړ شدت رڼا لاندې وده کوي (په ترتیب سره 10، 30 یا 300μMm-2 s-1)، پروټین W او RC-L فرعي واحدونه په پاک شوي کمپلیکس او جلا شوي غشا تناسب کې دي. د SDS-polyacrylamide gel electrophoresis او immunosay په واسطه د پروټین کچه معلومه کړئ (د خامو معلوماتو لپاره شکل S9 وګورئ). د پاک شوي RC-LH114-W کمپلیکس سره نسبت تناسب معلوم کړئ. د کمپلیکس د پروټین-W سره د RC-L سټوچیومیټریک تناسب 1:1 دی.
د RC-LH114-W (شکل 1، A، C، او E) د خراب شوي αβ14 لوپ کې په 1 موقعیت کې BChls د RC-LH116 (شکل 1، B، D، او F، او شکل S3) کې د مساوي BChls په پرتله د 6.8Å لخوا د RC لومړني ډونر (P) ته نږدې دي؛ په هرصورت، د دوو کمپلیکسونو انتقالي جذب کینیټکس ښیي چې د RC-LH114-W او RC-LH116 لپاره، د LH1 څخه RC ته د هڅونې انرژي لیږد وخت ثابتونه 40 ± 4 او 44 ± 3 ps دي (شکل 2). ، C او D، شکل S4 او جدول S2). د RC دننه د بریښنایی لیږد کې هم د پام وړ توپیر شتون نلري (شکل S5 او اړوند ضمیمه متن). موږ شک لرو چې د LH1 او RC-P ترمنځ د انرژي لیږد وخت نږدې اړیکه د LH1 په دوو لوپونو کې د ډیری BChl د ورته واټن، زاویې او احتمالي انرژۍ له امله ده. داسې ښکاري چې د LH1 انرژۍ نمونې سپړنه د لږترلږه واټن ته د رسیدو لپاره د فرعي غوره ځایونو څخه RC ته د مستقیم انرژۍ لیږد څخه ګړندی نه دی. په RC-LH114-W کې د خلاص لوپ LH1 لوپ ممکن د ساختماني تحلیل لپاره د ټیټ تودوخې شرایطو لاندې د پام وړ حرارتي حرکت څخه هم تیر شي، او د RC 1 موقعیت کې د βBChls د رنګ کولو واټن څخه د خونې په حرارت کې اوږد αβ14 حلقوي جوړښت شتون لري.
د RC-LH116 کمپلیکس 32 BChls او 16 کیروټینایډونه لري، او د هغې ټولیز ترتیب د Thermochromatium (Tch.) pidpidum [پروټین ډیټا بانک (PDB) ID 5Y5S] (9)، Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) او شنه الګی (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) څخه ترلاسه شوي سره ورته دی. د سمون وروسته، د αβ heterodimers په موقعیتونو کې یوازې کوچني انحرافات لیدل شوي، په ځانګړې توګه 1-5، 15، او 16 (شکل S6). د پروټین-W شتون د LH1 په جوړښت باندې د پام وړ اغیزه لري. د هغې درې TMHs د لنډو لوپونو سره وصل دي، د N-ټرمینل د کمپلیکس د لیمن اړخ کې او C-ټرمینل د سایټوپلاسمیک اړخ کې (شکلونه 1A او 3، A څخه D). پروټین-W په لویه کچه هایدروفوبیک دی (شکل 3B)، او TMH2 او TMH3 د LH1αβ-14 سره تعامل کوي ترڅو د ټرانس میمبرین سطحه جوړه کړي (شکل 3، B او E څخه G). انٹرفیس په عمده توګه د ټرانس میمبرین سیمه کې د Phe، Leu او Val پاتې شونو څخه جوړ شوی دی. دا پاتې شونه د هایدروفوبیک امینو اسیدونو او αβ-14 رنګونو سره ډک شوي دي. ځینې قطبي پاتې شونه هم په تعامل کې مرسته کوي، په شمول د پیچلي غار په سطحه د W-Thr68 او β-Trp42 ترمنځ د هایدروجن بانډ (شکل 3، F او G). د سایټوپلازم په سطحه، Gln34 د αβ-14 کیروټینایډونو کیټو ګروپ سره نږدې دی. سربیره پردې، د n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) مالیکول حل شو، او د هغې هایدروفوبیک لکۍ د پروټین-W او αβ-14 ترمنځ انٹرفیس ته غځول شوې، او د لیپید لکۍ ممکن په بدن کې موقعیت ولري. موږ دا هم ولیدل چې د پروټین W او RCH د C-ټرمینل ریزولوشن سیمې خورا نږدې دي، مګر د ځانګړو تعاملاتو د جوړولو په ساحه کې ندي (شکل 1، A او E). په هرصورت، ممکن د دې دوو پروټینونو په نا حل شوي C-ټرمینل امینو اسیدونو کې تعاملات شتون ولري، کوم چې ممکن د RC-LH114-W کمپلیکس د راټولولو په جریان کې د پروټین-W استخدام لپاره میکانیزم چمتو کړي.
(الف) پروټین-W، چې د کارټون په بڼه د LH1αβ14 سره د انٹرفیس سره مخ کیږي، د راډ په شکل د اړخ زنځیر (سور) لري، چې د الیکټروسټاټیک پوټینشیل ډیاګرام په یوه برخه کې ښودل شوی (شفاف خړ سطح د 0.13 کنټور کچې سره). (ب) پروټین-W د هایدروفوبیک رنګه سطح لخوا ښودل شوی. قطبي او چارج شوي سیمې په سیان کې ښودل شوي، هایدروفوبیک سیمې په سپین کې ښودل شوي، او قوي هایدروفوبیک سیمې په نارنجي کې ښودل شوي. (ج او ډ) پروټین-W په کارټون کې ښودل شوی، د هغې سمت د (A) (C) سره ورته دی، او د 180° (D) لخوا ګرځول شوی. په ترتیب کې د موقعیت سره سم، د توپیر وړ پاتې شوني د رینبو رنګ سکیم غوره کوي، چیرې چې N-ټرمینل نیلي دی او C-ټرمینل سور دی. (ج) پروټین-W په ورته لید کې لکه (A)، او د پروټین-W:LH1 په انٹرفیس کې پاتې شوني د نښو سره د راډونو لخوا ښودل شوي. (F) پروټین-W د کارټون نمایش کې د (E) او LH1αβ14 په پرتله 90 درجې څرخیږي، او د بار نمایش کې د انٹرفیس پاتې شونو په پرتله. د بیټا پولیپټایډ څخه ډیر ځړیدلي پاتې شونه لیبل شوي دي. کوفیکٹر د شکل 1 رنګ سره سمون لرونکي بار په توګه ښودل شوی، تجزیه شوی β-DDM په خړ رنګ کې ښودل شوی، او اکسیجن په سور رنګ کې ښودل شوی. (G) په (F) کې لید 180 درجې څرخیږي، د لیبل شوي الفا پولیپټایډ د مهمو پاتې شونو سره.
پروټین-W د αβ هیتروډیمر (په شکل 1F کې 15م) ځای نیسي، په دې توګه د حلقې بندیدو مخه نیسي او د لومړیو دریو αβ هیتروډیمرونو خم کوي. دا لیدل شوي چې د فلم نورمال په پرتله د لومړي αβ-1 هیتروډیمر اعظمي تمایل زاویه 25° څخه تر 29° پورې وه (شکل 1، A او E)، کوم چې د RC A تیز برعکس-LH116 (شکل 1، B او F) کې د αβ-1 د 2° څخه تر 8° تمایل لخوا رامینځته شوی. دوهم او دریم هیتروډیمر په ترتیب سره په 12° څخه تر 22° او 5° څخه تر 10° پورې تمایل لري. د RC د سټیریک خنډ له امله، د αβ-1 خم د αβ دوهمه جوړه نه شاملوي (کوم چې په شکل 1F کې د 16th αβ سره مطابقت لري)، پدې توګه د LH1 حلقه کې یو روښانه تشه جوړوي (شکل 1، A او E). د دوو αβ هیټروډیمرونو د نشتوالي له امله، د څلورو BChl او دوه carotenoids له لاسه ورکولو سره، هیڅ یو carotenoid د تاو شوي αβ-1 فرعي واحد سره نه تړل کیږي، چې په پایله کې د LH114-W حلقه رامینځته کیږي چې 13 carotenoids Vegetarian او 28 BChls لري. د αβ1 څخه تر 7 سیمو کې د دوو کمپلیکسونو د محلي ریزولوشن اټکلونه د LH1 لوپ د پاتې نورو برخو په پرتله ټیټ دي، کوم چې ممکن د RC QB سایټ سره نږدې د LH1 فرعي واحد ذاتي پلاستیکیت منعکس کړي (شکل 4).
د RC-LH114-W (A او B) او RC-LH116 (C او D) انځورونه د ورته پورتنۍ لید / اړخ لید (A او B) (A او C) او د شکل 1 (B او D) د غار سطحې څخه ښودل شوي دي. رنګین کیلي په ښي خوا کې ښودل شوي.
یوازینی بل ځانګړتیا لرونکی کور کمپلیکس چې د 1:14 د سټوچیومیټریک تناسب سره د روډوکوکس سفایروایډز (Rba.) RC-LH1-PufX ډیمر (13) دی. په هرصورت، پروټین W او PufX هیڅ څرګند هومولوژي نلري، او په خپلو اړوندو LH1 جوړښتونو باندې د پام وړ اغیزه لري. PufX یو واحد TMH دی چې د N-ټرمینل سایټوپلاسمیک ډومین لري چې د RC-H سبونیټ (13) د سایټوپلاسمیک اړخ سره د Rps. palustris LH116αβ-16 سره په مطابقت کې تعامل کوي. PufX د RC-LH1 او سایټوکروم bcl کمپلیکس ترمنځ د کوینون/کوینولون تبادلې لپاره یو چینل رامینځته کوي او په ټولو Rba. sphaeroides کور کمپلیکس (13) کې شتون لري. که څه هم د مونومر-مونومر انٹرفیس په Rba کې دی. د سفایروایډز RC-LH1-PufX ډیمر په RC-LH114-W کې د پروټین W په تړلو موقعیت کې موقعیت لري، او د PufX او پروټین-W لخوا رامینځته شوی تشه په مساوي موقعیت کې ده (شکل S7A). په RC-LH114-W کې تشه د Pseudomonas rosea LH1 د فرضي کوینون چینل (8) سره هم سمون لري، کوم چې د پیپټایډونو لخوا رامینځته کیږي چې د پروټین W یا PufX سره تړاو نلري (شکل S7B). سربیره پردې، په Blc کې د کوینون چینل. د زمرد شنه LH1 د یو γ فرعي واحد (7) پریښودو سره رامینځته شوی په ورته موقعیت کې موقعیت لري (شکل S7C). که څه هم د مختلفو پروټینونو لخوا منځګړیتوب شوی، د RC-LH1 کمپلیکس کې په یو عام موقعیت کې د دې کوینون / کوینولول چینلونو څرګندیدل د متقابل ارتقا یوه بیلګه ښکاري، دا په ګوته کوي چې د پروټین W لخوا رامینځته شوی تشه ممکن د کوینون چینل په توګه عمل وکړي.
په LH114-W لوپ کې تشه د RC-LH114-W کمپلیکس داخلي ځای او بلک میمبرین (شکل 1G) ترمنځ د دوامداره میمبرین سیمې جوړولو ته اجازه ورکوي، د پروټین په څیر د پروټین سوري له لارې د دوه ډومینونو سره نښلولو پرځای. د RC-LH116 کمپلیکس د تړل شوي Tch سره ورته دی. د ستنې په څیر کمپلیکس (22) (شکل 1H). څرنګه چې د میمبرین له لارې د کوینون خپریدل د تنګ پروټین چینل له لارې د خپریدو په پرتله ګړندي دي، خلاص LH114-W لوپ کولی شي د تړل شوي LH116 لوپ په پرتله ګړندي RC بدلون ته اجازه ورکړي، او RC ته د کوینون خپریدل ممکن ډیر محدود وي. د دې لپاره چې ازموینه وکړو چې ایا پروټین W د RC له لارې د کوینون بدلون اغیزه کوي، موږ د یوبیکوینون 2 (UQ2) په یو ټاکلي غلظت کې د سایټوکروم اکسیډیشن ازموینه ترسره کړه (د طبیعي UQ10 یو انلاګ د لنډ اسوپرین لکۍ سره) (شکل 2E). که څه هم د چیلیټ شوي کوینون شتون د ظاهري مایکلیس ثابت (RC-LH114-W او RC-LH116 په ترتیب سره د 0.2±0.1μM او 0.5±0.2μM لپاره مناسب دي) د دقیق ټاکلو مخه نیسي، د RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) اعظمي کچه د RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) په پرتله 28±5٪ لویه ده.
موږ په پیل کې اټکل وکړ چې پروټین-W د اصلي کمپلیکس شاوخوا 10٪ کې شتون لري (16)؛ دلته، د ټیټ رڼا، منځنۍ رڼا، او لوړ رڼا ودې حجرو د اشغال کچه په ترتیب سره 15±0.6٪، 11±1٪ او 0.9±0.5 ده (شکل 2F). د ډله ایز سپیکٹرومیټري کمیتي پرتله کول ښیې چې د هسټیډین ټګ اضافه کول د وحشي ډوله سټرینونو په پرتله د پروټین-W نسبي کثرت کم نه کړ (P = 0.59)، نو دا کچې د تعدیل شوي پروټین-W (شکل S10) یوه نمونه نه ده. په هرصورت، په RC-LH1 کمپلیکس کې د پروټین-W دا ټیټ اشغال ممکن ځینې RCs ته اجازه ورکړي چې په ګړندۍ کچه کې فلپ شي، په دې توګه د RC-LH116 کمپلیکس کې د ورو کوینون/کوینولون تبادلې کموي. موږ ولیدل چې د لوړ رڼا د اشغال کچه د وروستي ټرانسکرپټومیک معلوماتو سره مطابقت نلري، کوم چې دا په ګوته کوي چې د قوي رڼا لاندې د pufW جین څرګندونه زیاتیږي (شکل S11) (23). د RC-LH1 کمپلیکس کې د pufW ټرانسکرپشن او پروټین-W شاملولو ترمنځ توپیر مغشوشونکی دی او ممکن د پروټین پیچلي تنظیم منعکس کړي.
په RC-LH114-W کې، 6 کارډیولیپین (CDL)، 7 فاسفیټایډیلچولین (POPC)، 1 فاسفیټایډیلګلیسیرول (POPG) او 29 β-DDM مالیکولونه په کې تخصیص شوي او ماډل شوي دي 6 CDLs، 24 POPCs، 2 POPGs او 12 βDDMs. RC-LH116 (شکل 5، A او B). په دې دوو جوړښتونو کې، CDL تقریبا د کمپلیکس په سایټوپلاسمیک اړخ کې موقعیت لري، پداسې حال کې چې POPC، POPG او β-DDM ډیری یې په لومینل اړخ کې موقعیت لري. دوه لیپید او ډیټرجنټ مالیکولونه د RC-LH114-W کمپلیکس (شکل 5A) په αβ-1 څخه αβ-6 سیمه کې جلا شوي، او پنځه د RC-LH116 (شکل 5B) په مساوي سیمه کې جلا شوي. د کمپلیکس په بل اړخ کې ډیر لیپیدونه وموندل شول، په عمده توګه CDL، چې د RC او αβ-7 څخه تر αβ-13 پورې راټول شوي وو (شکل 5، A او B). نور ساختماني حل شوي لیپیدونه او صابونونه د LH1 حلقې څخه بهر موقعیت لري، او ښه حل شوي اسیل زنځیرونه د LH1 فرعي واحدونو ترمنځ غځیږي، په لنډمهاله توګه په RC-LH114-W کې د β-DDM په توګه نومول شوي، او په RC کې د β-DDM په توګه تعریف شوي د β-DDM او POPC-LH116 مخلوط. زموږ په جوړښت کې د چیلیټینګ لیپیدونو او صابونونو ورته موقعیتونه ښیې چې دوی په فزیولوژیکي توګه اړونده تړلي ځایونه دي (شکل S12A). په Tch کې د مساوي مالیکولونو موقعیتونه هم ښه ثبات لري. نرم او Trv. د 970 RC-LH1s سټرین (شکل S12، B څخه تر E پورې) (9، 12) او د لیپید سر ګروپ د هایدروجن-بانډینګ پاتې شونو د ترتیب په ترتیب کې خورا ښه ساتنه ښودلې (شکل S13)، دا په ګوته کوي چې ساتل شوي CDL چې د RC (24) سره تړلي دي، دا سایټونه ممکن په RC-LH1 کمپلیکس کې خوندي شي.
(A او B) RC-LH114-W (A) او RC-LH116 (B) پیپټایډونه د کارټونونو لخوا ښودل شوي، او رنګونه د راډونو لخوا ښودل شوي، د رنګ سکیم په کارولو سره په شکل 1 کې. لیپیدونه په سور رنګ کې ښودل شوي، او ډیټرجنټونه په خړ رنګ کې ښودل شوي. د RC QA او QB سایټونو سره تړلی UQ ژیړ دی، پداسې حال کې چې جلا شوی UQ نیلي دی. (C او D) د (A) او (B) سره ورته لیدونه، د لیپیدونو پریښودل سره. (E څخه G) د RC-LH116 څخه د Q1(E)، Q2(F) او Q3(G) پراخه لید، د اړخ زنځیرونو سره چې یو بل اغیزه کوي. د هایدروجن بانډونه د تور ډیش شوي کرښو په توګه ښودل شوي.
په RC-LH116 کې، دواړه RC QA او QB UQ، چې د چارج جلا کولو پروسې کې د الکترون لیږد کې برخه اخلي، په خپلو تړلو ځایونو کې تجزیه کیږي. په هرصورت، په RC-LH114-W کې، QB کوینون حل شوی نه دی او لاندې به په تفصیل سره بحث وشي. د QA او QB کوینونونو سربیره، دوه چیلیټ شوي UQ مالیکولونه (د RC او LH1 حلقو ترمنځ موقعیت لري) د RC-LH114-W جوړښت کې د دوی د ښه حل شوي سر ګروپونو (په ترتیب سره Q1 او Q2 کې موقعیت لري) سره سم تخصیص شوي دي. ځای). شکل 5C). دوه ایزوپرین واحدونه Q1 ته ټاکل شوي، او د کثافت نقشه د Q2 بشپړ 10 ایزوپرین لکۍ حل کوي. د RC-LH116 په جوړښت کې، درې چیلیټ شوي UQ10 مالیکولونه (Q1 څخه Q3، شکل 5D) حل شوي، او ټول مالیکولونه د لکۍ په اوږدو کې روښانه کثافت لري (شکل 5، D څخه G). په دوو جوړښتونو کې، د Q1 او Q2 د کوینون سر ګروپونو موقعیتونه غوره ثبات لري (شکل S12F)، او دوی یوازې د RC سره تعامل کوي. Q1 د RC-LH114-W د W تشې په دروازه کې موقعیت لري (شکل 1G او 5، C، D او E)، او Q2 د QB تړلو سایټ ته نږدې موقعیت لري (شکل 5، C، D) او F). ساتل شوي L-Trp143 او L-Trp269 پاتې شوني Q1 او Q2 ته ډیر نږدې دي او د احتمالي π-سټیکینګ تعاملات چمتو کوي (شکل 5، E او F، او شکل S12). L-Gln88، د Q1 د لرې اکسیجن څخه 3.0 Å، یو قوي هایدروجن بانډ چمتو کوي (شکل 5E)؛ دا پاتې شوني په ټولو RCs کې ساتل کیږي پرته له خورا لرې اړیکې (شکل S13). L-Ser91 په ډیری نورو RCs کې د Thr لپاره په محافظه کار ډول ځای په ځای شوی دی (شکل S13)، د Q1 د میتیل اکسیجن څخه 3.8 انګسټروم دی، او ممکن ضعیف هایدروجن بانډونه چمتو کړي (شکل 5E). Q3 داسې نه ښکاري چې ځانګړی تعامل ولري، مګر د RC-M سبونیټ او LH1-α سبونیټ 5 څخه تر 6 پورې د هایدروفوبیک سیمه کې موقعیت لري (شکل 5، D او G). Q1، Q2 او Q3 یا نږدې چیلیټ شوي کوینونونه هم په Tch. Gentle، Trv. Strain 970 او Blc کې حل شوي دي. د ایرس جوړښت (9، 10، 12) د RC-LH1 کمپلیکس (شکل S12G) کې د محافظت شوي مرستندویه کوینون پابند ځای ته اشاره کوي. په RC-LH116 کې پنځه تجزیه شوي UQs د هر کمپلیکس د 5.8±0.7 سره ښه موافق دي چې د لوړ فعالیت مایع کروماتګرافي (HPLC) لخوا ټاکل کیږي، پداسې حال کې چې په RC-LH114-W کې درې تجزیه شوي UQs د 6.2±0.3 اندازه شوي ارزښت (شکل S14) څخه ټیټ دي چې په جوړښت کې نا حل شوي UQ مالیکولونه شتون لري.
د جعلي-سمیټریک L او M پولیپپټایډونو هر یو پنځه TMHs لري او یو هیټروډیمر جوړوي چې یو BChl ډایمر، دوه BChl مونومر، دوه باکتریوفیج (BPh) مونومر، او یو غیر هیم اوسپنه او یو یا دوه UQ10 مالیکولونه سره یوځای کوي. د ټرمینل کیټون ګروپ کې د هایدروجن بانډونو شتون او په Rps کې د هغې پیژندل شوي راټولیدو له لارې، کیروټینایډونه په M-subunit کې شامل شوي، کوم چې cis-3,4-dehydroorhodopin نومیږي. ډولونه (25). د RC-H بهرنۍ غشا ډومین د یو واحد TMH لخوا غشا ته لنگر شوی. د RC ټولیز جوړښت د اړوندو ډولونو (لکه Rba) د دریو فرعي واحد RC سره ورته دی. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). د BChl او BPh میکروسایکلونه، د کاروټینایډ ملا تیر او غیر هیم اوسپنه د دې جوړښتونو د ریزولوشن رینج دننه سره یوځای کیږي، لکه څنګه چې د QA سایټ کې د UQ10 سر ګروپ او د RC-LH116 کې QB کوینون (شکل S15).
د دوه RC جوړښتونو شتون چې د QB سایټ د اشغال مختلف نرخونه لري د QB کوینون سره د دوامداره جوړښتي بدلونونو معاینه کولو لپاره یو نوی فرصت برابروي. په RC-LH116 کمپلیکس کې، QB کوینون په بشپړ ډول تړل شوي "نږدې" موقعیت کې موقعیت لري (26)، مګر د RC-LH114-W جلا کول QB کوینون نلري. په RC-LH114-W کې هیڅ QB کوینون نشته، کوم چې د حیرانتیا خبره ده ځکه چې کمپلیکس فعال دی، د RC-LH116 کمپلیکس په پرتله چې په ساختماني ډول حل شوي QB کوینون لري. که څه هم دوه LH1 حلقې شاوخوا شپږ کوینونونه چیلیټ کوي، پنځه یې په ساختماني ډول په تړل شوي RC-LH116 حلقه کې حل شوي، پداسې حال کې چې یوازې درې یې په ساختماني ډول په خلاص RC-LH114-W حلقه کې محدود دي. دا زیات شوی ساختماني اختلال ممکن د RC-LH114-W QB سایټونو ګړندي ځای په ځای کولو، په کمپلیکس کې د کوینون چټک کایناتیک، او د LH1 لوپ څخه د تیریدو احتمال زیاتیدو منعکس کړي. موږ وړاندیز کوو چې د RC-LH114-W د RC QB سایټ کې د UQ نشتوالی ممکن د ډیر پیچلي او ډیر فعال کمپلیکس پایله وي، او د RC-LH114-W QB سایټ سمدلاسه د UQ بدلون کې کنګل شوی دی. ځانګړی مرحله (د QB سایټ ته ننوتل تړل شوی) د دې فعالیت جوړښت منعکس کوي.
د QB پرته، د L-Phe217 سره یوځای ګرځیدل داسې موقعیت ته چې د UQ10 تړلو سره مطابقت نلري، ځکه چې دا به د لکۍ د لومړي ایزوپرین واحد سره د فضايي ټکر لامل شي (شکل 6A). سربیره پردې، څرګند اصلي جوړښتي بدلونونه څرګند دي، په ځانګړي توګه هیلیکس ډی (د TMH D او E ترمنځ په لوپ کې لنډ هیلیکس) چیرې چې L-Phe217 د QB تړلو جیب ته لیږدول کیږي او د L-Tyr223 گردش (شکل 6A) د M-Asp45 چوکاټ سره د هایدروجن بانډ ماتولو او د QB تړلو سایټ د ننوتلو بندولو لپاره (شکل 6B). هیلیکس ډی په خپل اساس کې محور کوي، د L-Ser209 Cα د 0.33Å لخوا لیږدول کیږي، پداسې حال کې چې L-Val221Cα د 3.52Å لخوا لیږدول کیږي. په TMH D او E کې د لیدلو وړ بدلونونه شتون نلري، کوم چې په دواړو جوړښتونو کې سپر امپوز وړ دي (شکل 6A). تر هغه ځایه چې موږ پوهیږو، دا په طبیعي RC کې لومړی جوړښت دی چې د QB سایټ بندوي. د بشپړ (QB سره تړلي) جوړښت سره پرتله کول ښیې چې مخکې لدې چې کوینون کم شي، د کوینون ته د ننوتلو لپاره یو جوړښتي بدلون ته اړتیا ده. L-Phe217 د کوینون سر ګروپ سره د π-سټیکینګ تعامل رامینځته کولو لپاره څرخیږي، او هیلیکس بهر ته حرکت کوي، د L-Gly222 کنکال او د L-Tyr223 اړخ زنځیر ته اجازه ورکوي چې د هایدروجن بانډ شبکې د مستحکم هایدروجن بانډ جوړښت سره جوړ کړي (شکل 6، A او C).
(الف) د هولوګرام (L زنځیر، نارنجي/M زنځیر، میجنټا) او اپو (خړ) جوړښت یو بل سره تړلی کارتون، په کوم کې چې کلیدي پاتې شوني د راډ په څیر استازیتوب په بڼه ښودل شوي. UQ10 د ژیړ بار لخوا ښودل شوی. نقطه شوې کرښه په ټول جوړښت کې رامینځته شوي هایدروجن بانډونه په ګوته کوي. (B او C) د اپولیپوپروټین او ټول حلقوي جوړښت سطحي استازیتوب، په ترتیب سره د L-Phe217 د اړخ زنځیر اکسیجن په نیلي او L-Tyr223 په سور کې روښانه کوي. د L فرعي واحد نارنجي دی؛ د M او H فرعي واحدونه رنګ شوي ندي. (D او E) اپولیپوپروټین (D) او ټول (E) RC QB سایټونه [په ترتیب سره د (A) لخوا رنګ شوي] او ترموفیلس ترموفیلس PSII (شنه، نیلي د پلاستيکي کوینون سره؛ PDB ID: 3WU2) سمون (58).
په ناڅاپي ډول، که څه هم د LH1 پرته د QB کمښت لرونکي RCs ډیری جوړښتونه شتون لري، په دې څیړنه کې لیدل شوي جوړښتي بدلونونه مخکې راپور شوي ندي. پدې کې د Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27)، Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) او Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) څخه د QB کمښت جوړښت شامل دي، چې ټول یې تقریبا د دوی د ټول QB جوړښت سره ورته دي. د 3PRC نږدې تفتیش څرګنده کړه چې د LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) صابون مالیکولونه د QB موقعیت په ننوتلو کې تړل کیږي، کوم چې ممکن د تړل شوي جوړښت کې د بیا تنظیم کولو مخه ونیسي. که څه هم LDAO په 1EYS یا 1OGV کې په ورته موقعیت کې نه تجزیه کیږي، دا RCs د ورته صابون په کارولو سره چمتو شوي او له همدې امله ممکن ورته اغیز تولید کړي. د Rba کرسټال جوړښت. د سایټوکروم c2 (PDB ID: 1L9B) سره ګډ کرسټال شوی Sphaeroides RC هم داسې ښکاري چې د QB تړل شوی سایټ لري. په هرصورت، پدې حالت کې، د RC-M پولیپټایډ N-ټرمینل سیمه (د Q هیلیکس په Tyr پاتې شونو کې د H بانډ له لارې د QB تړلو سایټ سره تعامل کوي) یو غیر طبیعي جوړښت غوره کوي، او د QB جوړښتي بدلون نور نه دی سپړل شوی (30). هغه څه چې ډاډمن دي دا دي چې موږ د RC-LH114-W جوړښت کې د M پولیپټایډ دا ډول خرابوالی نه دی لیدلی، کوم چې تقریبا د RC-LH116 RC د N-ټرمینل سیمې سره ورته دی. دا هم باید په پام کې ونیول شي چې د صابون پر بنسټ LH1 انټینا له منځه وړلو وروسته، په PDB کې د اپولیپوپروټین RCs حل شوي، کوم چې د RC او شاوخوا LH1 حلقې داخلي سطحې ترمنځ تشې کې داخلي کوینون حوضونه او لیپیدونه له منځه یوړل (31، 32). RC فعال پاتې کیږي ځکه چې دا ټول شریک فاکتورونه ساتي، پرته له دې چې د تحلیل وړ QB کوینون وي، کوم چې لږ مستحکم دی او ډیری وختونه د چمتووالي پروسې په جریان کې له لاسه ورکوي (33). سربیره پردې، دا معلومه ده چې د RC څخه د LH1 او طبیعي سایکلیک لیپیدونو لرې کول کولی شي په دندو اغیزه ولري، لکه د چارج جلا شوي P+QB حالت لنډ عمر (31، 34، 35). له همدې امله، موږ اټکل کوو چې د RC شاوخوا د محلي LH1 حلقې شتون ممکن د "تړل شوي" QB سایټ وساتي، په دې توګه د QB ته نږدې محلي چاپیریال ساتي.
که څه هم اپولیپوپروټین (د QB کوینون پرته) او بشپړ جوړښت د QB سایټ د بدلون یوازې دوه سنیپ شاټونه استازیتوب کوي، نه د پیښو لړۍ، داسې نښې شتون لري چې تړل د هایدروکوینون لخوا د بیا تړلو مخنیوي لپاره ګیټ کیدی شي ترڅو د سبسټریټ مخنیوی مخه ونیسي. د اپولیپوپروټین د QB سایټ ته نږدې د کوینولول او کوینون تعامل ممکن توپیر ولري، کوم چې د RC لخوا د هغې ردولو لامل کیږي. دا له اوږدې مودې راهیسې وړاندیز شوی چې د جوړښت بدلونونه د کوینونونو په تړلو او کمولو کې رول لوبوي. د تیاره تطابق وروسته د کوینونونو کمولو لپاره د منجمد RCs وړتیا ضعیفه کیږي (36)؛ د ایکس رې کریسټالوګرافي ښیې چې دا زیان د QB کوینونونو د فعال نږدې موقعیت څخه شاوخوا 4.5 Å په "لرې" جوړښت کې د بندیدو له امله دی (26)، 37). موږ وړاندیز کوو چې دا لرې پرتې تړلې بڼه د اپولیپوپروټین او بشپړ حلقوي جوړښت ترمنځ د منځنۍ حالت یوه لنډه کتنه ده، کوم چې د کوینون سره د لومړني تعامل او د QB سایټ د پرانستلو تعقیبوي.
د ځینو فوتوټروفیک باکتریا او سیانوباکټیریا، الجي او نباتاتو په PSII کمپلیکس کې موندل شوی ډول II RC جوړښتي او فعال محافظت لري (38). په شکل 6 (D او E) کې ښودل شوی جوړښتي سمون د PSII RCs او د باکتریا RC کمپلیکس د QB سایټ ترمنځ ورته والي ټینګار کوي. دا پرتله کول له اوږدې مودې راهیسې د کوینون تړلو او کمولو نږدې اړوند سیسټمونو مطالعې لپاره یو ماډل دی. پخوانیو خپرونو وړاندیز وکړ چې جوړښتي بدلونونه د کوینونونو د PSII کمولو سره مل دي (39، 40). له همدې امله، د RC د ارتقايي ساتنې په پام کې نیولو سره، دا دمخه نه لیدل شوی د تړلو میکانیزم ممکن د اکسیجن شوي فوتوټروفیک نباتاتو کې د PSII RC QB سایټ ته هم پلي شي.
Rps ΔpufW (بې نښه شوی pufW حذف کول) او PufW-His (C-ټرمینل 10x His-tagged protein-W چې د طبیعي pufW locus) strains څخه څرګند شوي. palustris CGA009 زموږ په تیرو کار (16) کې تشریح شوی. دا strains او isogenic wild-type parent د PYE (هر 5 g لیټر -1) (په LB کې په -80 °C کې زیرمه شوي، 50٪ (w/v) ګلیسیرول) پروټین، د خمیر استخراج او succinate) agar [1.5٪ (w/v)] پلیټ کې د لږ شمیر حجرو په سټرایک کولو سره له فریزر څخه ترلاسه شوي. پلیټ د شپې په تیاره کې د خونې د حرارت درجه کې د انیروبیک شرایطو لاندې انکیوبیټ شوی و، او بیا د سپینې رڼا (~50 μmolm-2 s-1) سره روښانه شوی و چې د OSRAM 116-W هالوجن بلبونو (RS Components، UK) لخوا چمتو شوی و چې د 3 څخه تر 5 ورځو پورې یو واحد کالونی څرګند شو. د یوې واحدې کالونۍ څخه د 10 ملی لیتر M22+ میډیم (41) د 0.1٪ (w/v) کاسامینو اسیدونو سره ضمیمه کولو لپاره کار اخیستل شوی و (له دې وروسته د M22 په نوم یادیږي). دا کلچر د ټیټ اکسیجن شرایطو لاندې په تیاره کې د 34 درجو سانتی ګراد په تیاره کې د 180 rpm په 48 ساعتونو کې د ټکان سره کرل شوی و، او بیا د کلچر 70 ملی لیتر د 24 ساعتونو لپاره په ورته شرایطو کې واکسین شوی و. د 1 ملی لیتر حجم سره نیم ایروبیک کلچر د 30 ملی لیتر M22 میډیم د 30 ملی لیتر یونیورسل سکرو ټاپ شفاف شیشې بوتل کې د واکسین کولو لپاره کارول کیږي او د تعقیم مقناطیسي ځواک سټیرینګ راډ لخوا د 48 ساعتونو لپاره د حرکت (~50μmolm-2 s-1) سره شعاع ورکول کیږي. بیا د کلچر 30 ملی لیتر د ورته شرایطو لاندې د شاوخوا 1 لیتر کلچر سره واکسین شوی و، چې بیا د 72 ساعتونو لپاره د ~200 μmolm-2 s-1 په روښانه شوي شاوخوا 9 لیتر کلچر د واکسین کولو لپاره کارول شوی و. حجرات د 30 دقیقو لپاره په 7132 RCF کې د سینټرفیوګیشن له لارې راټول شوي، د 20 mM tris-HCl (pH 8.0) په ~10 ملی لیتر کې بیا ځړول شوي، او تر اړتیا پورې په -20 ° C کې زیرمه شوي.
د ویلې کېدو وروسته، د ډی آکسی رایبونیوکلیز I (مرک، انګلستان)، لایزوزیم (مرک، انګلستان) او دوه روش هولوانزایم پروټیز انابیټر ټابلیټونو (مرک، انګلستان) ځینې کرسټالونه بیا ځنډول شوي حجرو ته اضافه کړئ. په 20,000 psi فرانسوي فشار حجرو (امینکو، امریکا) کې، حجرې له 8 څخه تر 12 ځله ګډوډې شوې. د 4 درجو سانتي ګراد په 18,500 RCF کې د 15 دقیقو لپاره د سینټرفیوګیشن لخوا د نه ماتیدونکي حجرو او نه حل کیدونکي کثافاتو لرې کولو وروسته، غشا د رنګ شوي لایسیټ څخه د سینټرفیوګیشن لخوا په 113,000 RCF کې د 2 ساعتونو لپاره په 43,000 درجو سانتي ګراد کې توی شوه. محلول کثافات پریږدئ او رنګ شوی غشا په 100 څخه تر 200 ملی لیتر 20 mM tris-HCl (pH 8.0) کې بیا وځنډوئ او تر هغه وخته پورې همغږي کړئ چې هیڅ څرګند مجموعه شتون ونلري. ځړول شوی غشا په 20 ملي میتر ټریس-ایچ سي ایل (pH 8.0) (اناټریس، امریکا) کې د 2٪ (w/v) β-DDM درلودونکي په تیاره کې د 1 ساعت لپاره په 4 درجو سانتي ګراد کې د نرم حرکت سره انکیوبیټ شو. بیا په 70 درجو سانتي ګراد کې سنټرفیوج وکړئ ترڅو 150,000 RCF په 4 درجو سانتي ګراد کې د 1 ساعت لپاره منحل کړئ ترڅو پاتې غیر حل کیدونکي مواد لرې کړئ.
د ΔpufW سټرین څخه د محلول کولو غشا د 50 ملی لیتر DEAE سیفاروز آیون تبادلې کالم ته د درې کالم حجم (CV) سره د پابند بفر [20 mM tris-HCl (pH 8.0) سره پلي شوه چې 0.03٪ (w / v) β-DDM لري]. کالم د دوه CV پابند بفرونو سره ومینځئ، او بیا کالم د دوه تړلو بفرونو سره ومینځئ چې 50 mM NaCl لري. RC-LH116 کمپلیکس په 1.75 CV کې د 150 څخه تر 300 mM NaCl (په تړلو بفر کې) د خطي ګریډینټ سره ایلیټ شوی و، او پاتې تړلو کمپلیکس د 0.5 CV کې د 300 mM NaCl لرونکي بانډنګ بفر سره ایلیټ شوی و. د جذب طیف د ۲۵۰ او ۱۰۰۰ نانو میتر ترمنځ راټول کړئ، د جذب تناسب (A880/A280) سره کسر د ۱ څخه ډیر په ۸۸۰ څخه تر ۲۸۰ نانو میتر پورې وساتئ، په بانډینګ بفر کې یې دوه ځله کم کړئ، او د پاکولو په وخت کې د DEAE کالم کې بیا ورته پروسیجر وکاروئ. هغه کسرونه چې د A880/A280 تناسب د ۱.۷ څخه لوړ او د A880/A805 تناسب د ۳.۰ څخه لوړ وي، د ایون تبادلې دریم پړاو ترسره کړئ، او هغه کسرونه وساتئ چې د A880/A280 تناسب د ۲.۲ څخه لوړ او د A880/A805 تناسب د ۵.۰ څخه لوړ وي. په جزوي ډول پاک شوی کمپلیکس د امیکون 100,000 مالیکولر وزن کټ آف (MWCO) سینټرفیوګال فلټر (مرک، انګلستان) کې تر ~2 ملی لیتر پورې متمرکز شوی و، او په سوپرډیکس 200 16/600 اندازه جلا کولو کالم (GE روغتیا پاملرنې، متحده ایالات) کې بار شوی و چې 200 mM NaCl بفر لري، او بیا په ورته بفر کې په 1.5 CV کې ایلوټ شوی و. د اندازې جلا کولو کسر د جذب سپیکٹرا راټول کړئ، او د جذب سپیکٹرا د A880/A280 تناسب سره د 2.4 څخه پورته او A880/A805 تناسب سره د 5.8 څخه تر 100 A880 څخه پورته متمرکز کړئ، او سمدلاسه یې د کریو-TEM گرډ چمتو کولو یا ذخیره کولو لپاره وکاروئ تر هغه چې اړتیا وي په -80°C کې وساتئ.
د PufW-His سټرین څخه د محلول کولو غشا د 20 ملی لیتر HisPrep FF Ni-NTA Sepharose کالم (20 mM tris-HCl (pH 8.0) کې چې 200 mM NaCl او 0.03٪ (w/w)) پکې شامل وو په IMAC بفر (GE Healthcare) کې تطبیق شوه. v) β-DDM]. ستون د IMAC بفر پنځه CVs سره مینځل شوی و، او بیا د IMAC بفر پنځه CVs سره چې پکې 10 mM هسټیډین شامل وو. اصلي کمپلیکس د 100 mM هسټیډین لرونکي پنځه IMAC بفرونو سره د ستون څخه ایستل شوی و. هغه برخه چې RC-LH114-W کمپلیکس لري په یوه محرک ټانک کې ~10 ملی لیتر ته متمرکزه ده چې د امیکون 100,000 MWCO فلټر (مرک، انګلستان) سره سمبال شوی، د پابند بفر سره 20 ځله حل شوی، او بیا 25 ملی لیتر ته اضافه شوی. په DEAE Sepharose کالم کې، څلور CVs چې د بفر سره تړلي دي مخکې له مخکې کارول کیږي. ستون د څلورو CV تړلو بفرونو سره ومینځئ، بیا په اتو CVs باندې د 0 څخه تر 100 mM NaCl (په تړلو بفر کې) د خطي ګریډینټ په واسطه کمپلیکس ایلوټ کړئ، او پاتې څلور CVs چې 100 mM تړلو بفر لري. پاتې کمپلیکسونه چې د سوډیم کلورایډ سره یوځای شوي د A880/A280 تناسب سره چې له 2.4 څخه لوړ او د A880/A805 تناسب چې له 4.6 څخه لوړ دي د امیکون 100,000 MWCO سینټرفیوګال فلټر کې ~2 ملی لیتر ته متمرکز شوي وو، او د 1.5 CV IMAC سره مخکې له مخکې ډک شوي وو. بفر د سوپرډیکس 200 16/600 اندازې استثنا کالم سره متوازن شوی، او بیا په ورته بفر کې د 1.5 CV څخه پورته ایلوټ شوی. د اندازې-استثنا کسرونو د جذب سپیکٹرا راټول کړئ او د جذب سپیکٹرا د A880/A280 تناسب سره د 2.1 څخه پورته او A880/A805 تناسب سره د 4.6 څخه تر 100 A880 څخه پورته متمرکز کړئ، کوم چې سمدلاسه د کنګل شوي TEM گرډ چمتو کولو لپاره کارول کیږي یا د اړتیا تر وخته پورې په -80 ° C کې زیرمه کیږي.
د ټیټې تودوخې TEM ګریډونو چمتو کولو لپاره د Leica EM GP ډوبولو فریزر کارول شوی و. کمپلیکس په IMAC بفر کې د 50 A880 ته حل شو، او بیا 5μl د نوي ګلو خارج شوي QUANTIFOIL 1.2/1.3 کاربن پوښل شوي مسو میش باندې بار شو (Agar Scientific, UK). ګریډ په 20°C او 60% نسبي رطوبت کې د 30 ثانیو لپاره واچوئ، بیا یې د 3 ثانیو لپاره وچ کړئ، او بیا یې په مایع ایتان کې -176°C کې ومینځئ.
د RC-LH114-W کمپلیکس معلومات په eBIC (بریښنایی بایو امیجینګ مرکز) (د برتانوي الماس رڼا سرچینه) کې د ټایټان کریوس مایکروسکوپ سره ثبت شوي، کوم چې د 300kV په سرعت ولټاژ کې کار کوي، د 130,000 × نومول شوي میګنیفیکیشن سره او د 20 eV تشه غوره کړئ. د ګاتان 968 GIF کوانټم د K2 چوکۍ کشف کونکي سره د معلوماتو راټولولو لپاره د شمیرنې حالت کې د عکسونو ثبتولو لپاره کارول شوی و. د کیلیبریټ شوي پکسل اندازه 1.048Å ده، او د خوراک کچه 3.83 e-Å-2s-1 ده. فلم یې په 11 ثانیو کې راټول کړ او په 40 برخو یې وویشلو. د مایکروسکوپ بیا تمرکز کولو لپاره د کاربن پوښل شوي ساحې څخه کار واخلئ، او بیا په هر سوري کې درې فلمونه راټول کړئ. په ټولیزه توګه، 3130 فلمونه راټول شوي، د -1 او -3μm ترمنځ د ډیفوکس ارزښتونو سره.
د RC-LH116 کمپلیکس لپاره معلومات د آسټربري بایوسټرکچر لابراتوار (د لیډز پوهنتون، انګلستان) کې د ورته مایکروسکوپ په کارولو سره راټول شوي. معلومات د شمېرنې په حالت کې د 130 k د زیاتوالي سره راټول شوي، او د پکسل اندازه د 4.6 e-Å-2s-1 دوز سره 1.065 Å ته کیلیبریټ شوې. فلم په 12 ثانیو کې ثبت شو او په 48 برخو ویشل شو. په ټولیز ډول، 3359 فلمونه راټول شوي، چې د -1 او -3μm ترمنځ د ډیفوکس ارزښتونو سره.
ټول معلومات پروسس کول په ریلون 3.0 پایپ لاین کې ترسره کیږي (42). د خوراک وزن کولو له لارې د بیم حرکت سمولو لپاره Motioncorr 2 (43) وکاروئ، او بیا د CTF (برعکس لیږد فعالیت) پیرامیټر ټاکلو لپاره CTFFIND 4.1 (44) وکاروئ. د دې لومړني پروسس مرحلو وروسته عادي فوټومیکروګرافونه په شکل 2 کې ښودل شوي. S16. د اتوماتیک انتخاب ټیمپلیټ د 250 پکسل چوکاټ کې د 1000 ذراتو شاوخوا 250 پکسلونو په لاسي ډول غوره کولو او د دوه اړخیزه (2D) طبقه بندي هیڅ حواله نه کولو سره رامینځته کیږي، په دې توګه هغه طبقه بندي ردوي چې د نمونې ککړتیا پوره کوي یا هیڅ د پام وړ ځانګړتیاوې نلري. بیا، په ټولو مایکرو فوټوګرافونو کې اتوماتیک انتخاب ترسره شو، او RC-LH114-W 849,359 ذرات وو، او RC-LH116 کمپلیکس 476,547 ذرات وو. ټول غوره شوي ذرات د غیر حوالې 2D طبقه بندي دوه پړاوونه تیر کړي دي، او د هرې دورې وروسته، هغه ذرات چې د کاربن ساحې سره سمون لري، د نمونې ککړتیا، هیڅ څرګند ځانګړتیاوې یا په کلکه سره یوځای شوي ذرات رد شوي، چې په پایله کې یې 772,033 (90.9٪) او 359,678 (75.5٪) ذرات په ترتیب سره د RC-LH114-W او RC-LH116 د 3D طبقه بندي لپاره کارول کیږي. د 3D لومړني حوالې ماډل د سټوکاسټیک ګریډینټ ډیسنټ میتود په کارولو سره رامینځته شوی. د لومړني ماډل د حوالې په توګه کارول، غوره شوي ذرات په 3D کې په څلورو کټګوریو کې طبقه بندي شوي. پدې کټګورۍ کې ماډل د حوالې په توګه کارول، په لوی کټګورۍ کې د ذراتو 3D تصفیه ترسره کړئ، بیا د محلول ساحه پوښلو لپاره د لومړني 15Å ټیټ پاس فلټر وکاروئ، د نرمو څنډو 6 پکسلونه اضافه کړئ، او د پروسس وروسته پکسلونه د لوړ کشف کونکي د ګاتان K2 چوکۍ ماډلولیشن لیږد فعالیت سمولو لپاره وکاروئ. د RC-LH114-W ډیټاسیټ لپاره، دا لومړنی ماډل د ماسک په څنډو کې د قوي کثافت لرې کولو سره تعدیل شوی و (په UCSF چیمیرا کې د اصلي پیچلي کثافت څخه جلا شوی). پایله لرونکي ماډلونه (د RC-LH114-W او RC-LH116 ریزولوشنونه په ترتیب سره 3.91 او 4.16 Å دي) د 3D طبقه بندي دوهم پړاو لپاره د حوالې په توګه کارول کیږي. کارول شوي ذرات په لومړني 3D ټولګي کې ګروپ شوي او د ګاونډ سره قوي اړیکه نلري. اوورلیپ یا د څرګند ساختماني ځانګړتیاو نشتوالی. د 3D طبقه بندي دوهم پړاو وروسته، د لوړ ریزولوشن سره کټګوري غوره شوه [د RC-LH114-W لپاره، یوه کټګوري 377,703 ذرات (44.5٪) دي، د RC-LH116 لپاره، دوه کټګورۍ شتون لري، چې ټولټال 260,752 ذرات (54.7٪) دي، چیرې چې دوی یوازې هغه وخت ورته وي کله چې د لومړني گردش وروسته د کوچني توپیر سره سمون ولري]. ټاکل شوي ذرات په 400 پکسل بکس کې بیا استخراج کیږي او د 3D تصفیه کولو لخوا تصفیه کیږي. د محلول ماسک د لومړني 15Å ټیټ پاس فلټر، 3 پکسل نقشې پراخولو او 3 پکسل نرم ماسک په کارولو سره تولید کیږي. د هر ذرې CTF تصفیه، د هر ذرې حرکت اصلاح او د هر ذرې CTF تصفیه دوهم پړاو، 3D تصفیه، د محلول ماسک کول او وروسته پروسس کول د هر ګام وروسته ترسره کیږي ترڅو پایله لرونکي جوړښت نور هم تصفیه شي. د FSC (فوریر شیل ارتباط کوفیشینټ) کټ آف ارزښت 0.143 په کارولو سره، د RC-LH114-W او RC-LH116 وروستي ماډلونو ریزولوشن په ترتیب سره 2.65 او 2.80Å دي. د وروستي ماډل FSC منحنی په 2 شکل S17 کې ښودل شوی.
د پروټین ټول ترتیبونه د UniProtKB څخه ډاونلوډ شوي دي: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); پروټین-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) د RC د هومولوژي ماډل جوړولو لپاره کارول شوی و، کوم چې د RC-L، RC-M او RC-H پروټین ترتیبونه او د Rba کرسټال جوړښت لري. sphaeroides RC د ټیمپلیټ (PDB ID: 5LSE) (46) په توګه کارول شوی و. په UCSF Chimera کې د "fit map" وسیلې څخه کار واخلئ ترڅو تولید شوی ماډل په نقشه کې فټ کړئ (47)، د پروټین جوړښت ښه کړئ، او کوفیکٹر [4×BChl a (د مونومر کتابتون پاتې شونو نوم = BCL)، 2×BPh a (BPH)، یو یا دوه ډوله UQ10 (U10)، یو غیر هیم اوسپنه (Fe) او یو 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] د اضافه کولو لپاره Coot (48) وکاروئ. څرنګه چې QAK په مونومر کتابتون کې شتون نلري، نو دا په PHENIX (49) کې د eLBOW وسیلې په کارولو سره پیرامیټریز شوی.
بیا، د LH1 فرعي واحد جوړ شو. په پیل کې، په PHENIX (49) کې د اتوماتیک ساختماني وسیله د LH1 ترتیب برخه په اتوماتيک ډول د نقشې او LH1-α او LH1-β پروټین ترتیبونو په کارولو سره د ان پټ په توګه د جوړولو لپاره کارول کیده. ترټولو بشپړ LH1 فرعي واحد غوره کړئ، دا استخراج کړئ او په Coot کې یې بار کړئ، په لاسي ډول په کې ورک شوی ترتیب اضافه کړئ، او په لاسي ډول ټول جوړښت پاک کړئ مخکې لدې چې دوه BCls a (BCL) او یو spirilloxanthin (CRT) اضافه کړئ [د اړونده Rps مطابق د LH1 کمپلیکس کثافت او د پیژندل شوي کیروټینایډ مینځپانګې. ډولونه (17)]. بشپړ LH1 فرعي واحد کاپي کړئ، او د UCSF Chimera "ډاکینګ نقشې وسیلې" څخه کار واخلئ ترڅو د LH1 کثافت په نږدې غیر ماډل ساحه کې ډاک کړئ، او بیا یې په Coot کې پاک کړئ؛ پروسه تکرار کړئ تر هغه چې ټول LH1 فرعي واحدونه ماډل شوي نه وي. د RC-LH114-W جوړښت لپاره، په Coot کې د غیر تخصیص شوي کثافت په استخراجولو سره، پروټین د USCF Chimera نقشې کې د پاتې غیر پروټین اجزاو څخه جلا کیږي او د Autobuild وسیله د ابتدايي ماډل او پاتې فرعي واحدونو (پروټین-W) ماډلینګ د جوړولو لپاره کارول کیږي. په PHENIX (49) کې. په Coot (48) کې په پایله کې ماډل ته کوم ورک شوي ترتیبونه اضافه کړئ، او بیا په لاسي ډول ټول فرعي واحد اصلاح کړئ. پاتې غیر تخصیص شوي کثافت د لیپیدونو ترکیب سره سمون لري (د CDL = CDL، POPC = 6PL او POPG = PGT د PDB مونومر کتابتون ID)، β-DDM صابون (LMT) او UQ10 مالیکولونو (U10). د بشپړ لومړني ماډل بشپړولو لپاره په Coot (49) او لاسي اصلاح وکاروئ تر هغه چې د ماډل احصایې او د فټ بصري کیفیت نور ښه نشي. په پای کې، د محلي نقشې تیزولو لپاره LocScale (50) وکاروئ، او بیا د غیر تخصیص شوي کثافت او اتوماتیک او لاسي اصلاح کولو ماډل کولو څو نور دورې ترسره کړئ.
اړوند پیپټایډونه، کوفیکٹرونه او نور لیپیدونه او کوینونونه چې د دوی اړوند کثافتونو کې ډوب شوي دي په شکل 1 او 2 کې ښودل شوي دي. S18 څخه تر S23 پورې. د وروستي ماډل احصایوي معلومات په جدول S1 کې ښودل شوي.
پرته لدې چې بل ډول مشخص شوي وي، د UV/Vis/NIR جذب سپیکٹرا د Cary60 سپیکٹروفوټومیټر (Agilent، USA) کې د 1 nm وقفې کې د 250 nm څخه تر 1000 nm پورې او د 0.1s د ادغام وخت راټول شوي.
نمونه په کوارټز کیویټ کې د 2 ملي میتر لاره سره د A880 ته د 1 د لارې سره نرم کړئ، او د 400 او 1000 nm ترمنځ د جذب طیف راټول کړئ. ګردي ډیکرویک طیف د جاسکو 810 طیف پولاریمیټر (جاسکو، جاپان) کې د 1 nm وقفې کې د 400 nm او 950 nm ترمنځ د 20 nm دقیقې-1 سکین نرخ سره راټول شوي.
د مولر د له منځه تللو ضریب د کور کمپلیکس د A880 په شاوخوا 50 کې د کمولو له لارې ټاکل کیږي. د 10μl حجم په 990μl بانډینګ بفر یا میتانول کې کم کړئ، او د جذب سپیکٹرم سمدلاسه راټول کړئ ترڅو د BChl تخریب کم کړئ. د هر میتانول نمونې د BChl مینځپانګه د 54.8 mM-1 cm-1 د 771 nm په پای کې د ورکیدو ضریب لخوا محاسبه شوه، او د ورکیدو ضریب ټاکل شوی (51). د اندازه شوي BChl غلظت د 32 (RC-LH114-W) یا 36 (RC-LH116) لخوا تقسیم کړئ ترڅو د کور کمپلیکس غلظت مشخص شي، کوم چې بیا د بفر د له منځه تللو ضریب کې راټول شوي ورته نمونې د جذب سپیکٹرم ټاکلو لپاره کارول کیږي. موازي. د هرې نمونې لپاره درې تکراري اندازه اخیستل شوې، او د BChl Qy اعظمي جذب اوسط د محاسبې لپاره کارول شوی و. د RC-LH114-W د ورکېدو ضریب چې په 878 nm اندازه شوی 3280±140 mM-1 cm-1 دی، پداسې حال کې چې د RC-LH116 د ورکېدو ضریب چې په 880 nm اندازه شوی 3800±30 mM-1 cm-1 دی.
UQ10 د (52) په میتود سره سم اندازه شوی و. په لنډه توګه، د ریورس فیز HPLC (RP-HPLC) د Agilent 1200 HPLC سیسټم په کارولو سره ترسره شو. د RC-LH116 یا RC-LH114-W شاوخوا 0.02 nmol د 50:50 میتانول په 50μl کې حل کړئ: کلوروفارم چې 0.02٪ (w/v) فیریک کلورایډ لري، او مخکې متوازن بیکمن کولټر الټراسفیر ODS 4.6 ملي میتر انجیکشن کړئ په 1 ملی لیتر-1 دقیقه-1 کې د HPLC محلول (80:20 میتانول:2-پروپانول) کې په 40 ° C کې حل کړئ په ×25 سانتي متره ستون کې. د HPLC محلول کې د 275 nm (UQ10)، 450 nm (carotenoids) او 780 nm (BChl) کې د جذب څارنه لپاره د 1 ساعت لپاره اسوکراتیک ایلیوشن ترسره کړئ. په 275 nm کروماتگرام کې په 25.5 دقیقو کې لوړوالی مدغم شو، کوم چې نور کشف کیدونکي مرکبات نه درلودل. مدغم شوی ساحه د 0 څخه تر 5.8 nmol (شکل S14) پورې د خالص معیارونو انجیکشن څخه محاسبه شوي کیلیبریشن منحني په حواله د استخراج شوي UQ10 د مولر مقدار محاسبه کولو لپاره کارول کیږي. هر نمونه په دریو نقلونو کې تحلیل شوې، او راپور شوې تېروتنه د اوسط SD سره مطابقت لري.
یو محلول چې د RC-LH1 کمپلیکس لري چې اعظمي Qy جذب یې 0.1 و، د 30 μM کم شوي آس زړه سایټوکروم c2 (مرک، انګلستان) او 0 څخه تر 50 μMUQ2 (مرک، انګلستان) سره چمتو شو. د 1 ملی لیتر درې نمونې په هر UQ2 غلظت کې چمتو شوې او د شپې په تیاره کې په 4 درجو سانتي ګراد کې اچول شوې ترڅو د اندازه کولو دمخه تیاره سره بشپړ تطابق ډاډمن شي. محلول په OLIS RSM1000 ماډلر سپیکٹروفوټومیټر کې بار شوی و چې د 300 nm شعله/500 لاین ګریټینګ، 1.24 mm انلیټ، 0.12 mm منځنی او 0.6 mm آوټ لیټ سلیټونو سره سمبال شوی و. د نمونې فوټوټیوب او د حوالې فوټوملټیپلیر ټیوب په دروازه کې د 600 nm اوږد پاس فلټر ځای په ځای شوی ترڅو د جوش رڼا خارج کړي. جذب په 550 nm کې د 0.15 ثانیو د ادغام وخت سره څارل شوی و. د جوش رڼا د 880 nm M880F2 LED (د رڼا خپریدونکي ډایډ) (Thorlabs Ltd., UK) څخه د فایبر آپټیک کیبل له لارې د DC2200 کنټرولر (Thorlabs Ltd., UK) له لارې د 90٪ شدت سره خارج کیږي او د رڼا سرچینې ته د 90 درجې زاویه کې خارج کیږي. د اندازه کولو بیم د عکس سره مخالف دی ترڅو هر هغه رڼا بیرته راولي چې په پیل کې د نمونې لخوا جذب شوې نه وه. د 50 ثانیو د روښانتیا څخه دمخه د جذب 10 ثانیو څارنه وکړئ. بیا جذب په تیاره کې د 60 ثانیو لپاره نور هم وڅارل شو ترڅو ارزونه وشي چې کوینولول په ناڅاپي ډول سایټوکروم c23 + څومره کموي (د خام معلوماتو لپاره شکل S8 وګورئ).
معلومات د 0.5 څخه تر 10 ثانیو پورې د خطي ابتدايي نرخ په نصبولو سره پروسس شوي (د UQ2 غلظت پورې اړه لري) او د هر UQ2 غلظت کې د ټولو دریو نمونو د نرخونو اوسط کولو سره. د اړوند ختمیدو کوفیشینټ لخوا محاسبه شوی RC-LH1 غلظت د دې لپاره کارول شوی و چې نرخ د کتلټیک موثریت ته واړوي، چې په اوریجن پرو 2019 (اوریجن لیب، متحده ایالاتو) کې پلان شوی، او د مایکلیس-مینټین ماډل سره فټ شوی ترڅو د څرګند کیلومتر او Kcat ارزښتونه مشخص کړي.
د انتقالي جذب اندازه کولو لپاره، د RC-LH1 نمونه په IMAC بفر کې ~2μM ته کمه شوې وه چې 50 mM سوډیم اسکوربیټ (مرک، امریکا) او 0.4 mM ټربوټین (مرک، امریکا) لري. اسکوربیک اسید د قربانۍ الکترون ډونر په توګه کارول کیږي، او ټیرټ-بوټاکلوفین د QB مخنیوی کونکي په توګه کارول کیږي ترڅو ډاډ ترلاسه شي چې د اندازه کولو په ټوله پروسه کې اصلي RC ډونر کم پاتې کیږي (یعنې، فوتو اکسیډیز شوی نه دی). نږدې 3 ملی لیتره نمونه د 2 ملي میتر آپټیکل لارې اوږدوالي سره د دودیز څرخیدونکي حجرې (شاوخوا 0.1 متر قطر، 350 RPM) ته اضافه کیږي ترڅو ډاډ ترلاسه شي چې د لیزر لارې کې نمونه د جوش نبضونو ترمنځ د تیاره تطابق لپاره کافي وخت لري. د Ti: سیفایر لیزر سیسټم (سپیکٹرا فزیک، امریکا) د لوړولو لپاره ~100-fs لیزر نبضونه وکاروئ ترڅو نمونه په 880 nm کې د 1 kHz (د NIR لپاره 20 nJ یا د Vis لپاره 100 nJ) د تکرار نرخ سره هڅوي. د معلوماتو راټولولو دمخه، نمونه د شاوخوا 30 دقیقو لپاره د جوش رڼا ته واچوئ. افشا کول به د QA غیر فعال کیدو لامل شي (ممکن یو یا دوه ځله QA کم کړي). مګر مهرباني وکړئ په یاد ولرئ چې دا پروسه بیرته راګرځیدونکې ده ځکه چې د تیاره تطابق اوږدې مودې وروسته، RC به ورو ورو د QA فعالیت ته راستون شي. د هیلیوس سپیکٹرومیټر (الټرا فاسټ سیسټمونه، متحده ایالات) د -10 څخه تر 7000 ps پورې د ځنډ وخت سره د انتقالي سپیکٹرا اندازه کولو لپاره کارول شوی و. د سرفیس ایکسپلورر سافټویر (الټرا فاسټ سیسټمونه، متحده ایالات) وکاروئ ترڅو د معلوماتو سیټونه غیر ګروپ کړئ، بیا یوځای کړئ او معیاري کړئ. د کارپیټ ویو سافټویر پیکج (لایټ کنورژن لمیټډ، لیتوانیا) وکاروئ ترڅو د تخریب پورې اړوند توپیري سپیکٹرا ترلاسه کولو لپاره ګډ ډیټا سیټ وکاروئ، یا هغه فعالیت وکاروئ چې د وسیلې غبرګون سره ډیری ایکسپونټونه راټولوي ترڅو په اصل (اوریجن لیب، متحده ایالات) کې د واحد طول موج طیف ارتقا سره سمون ولري.
لکه څنګه چې پورته یادونه وشوه (53)، د فوتوسنتیتیک فلم چې د LH1 کمپلیکس لري چې RC او پردی LH2 انتن دواړه نلري چمتو شوی و. غشا په 20 mM tris (pH 8.0) کې حل شوه او بیا د 2 mm آپټیکل لارې سره په کوارټز کیویټ کې بار شوه. د 30nJ لیزر نبض کارول شوی ترڅو نمونه په 540 nm کې د -10 څخه تر 7000 ps ځنډ وخت سره وهڅوي. د Rps. pal نمونې لپاره تشریح شوي ډیټا سیټ پروسس کړئ.
غشا د سینټرفیوګیشن له لارې د 150,000 RCF په واسطه د 2 ساعتونو لپاره په 4°C کې پیلیټ شوه، او بیا یې د 880 nm جذب په 20 mM tris-HCl (pH 8.0) او 200 mM NaCl کې بیا وځنډول شوه. غشا په ورو ورو په 2% (w/v) β-DDM کې د 1 ساعت لپاره په تیاره کې په 4°C کې حل کړئ. نمونه په 100 mM ټرای ایتیلامونیم کاربونیټ (pH 8.0) (TEAB؛ مرک، انګلستان) کې د 2.5 mg ml-1 پروټین غلظت ته حل شوه (د بایو-راډ تحلیل). نور پروسس د مخکې خپاره شوي میتود (54) څخه ترسره شو، د 50 μg پروټین د کمولو سره په ټولیزه توګه 50 μl TEAB کې پیل شو چې 1% (w/v) سوډیم لاوریټ (مرک، انګلستان) لري. د 60 ثانیو لپاره د سونیک کولو وروسته، دا د 5 ملي میتر ټریس (2-کاربوکسیتیل) فاسفین (مرک، انګلستان) سره د 30 دقیقو لپاره په 37 درجو سانتی ګراد کې کم شو. د S-alkylation لپاره، نمونه د 10 ملي میتر میتیل S-میتیلتیومیتان سلفونیټ (مرک، انګلستان) سره واچوئ او د 200 ملي میتر ایزوپروپانول سټاک محلول څخه یې د خونې په تودوخه کې د 10 دقیقو لپاره اضافه کړئ. د پروټیولیټیک هضم د 2 μg ټریپسین/اینډوپروټینیز لایس-سي مخلوط (پرومیګا انګلستان) اضافه کولو سره ترسره شو او د 3 ساعتونو لپاره په 37 درجو سانتی ګراد کې واچوئ. د لاوریټ سرفیکټینټ د 50 μl ایتیل اسټیټ او 10 μl 10٪ (v/v) LC درجې ټرای فلورواسیټیک اسید (TFA؛ ترمو فشر ساینسي، انګلستان) اضافه کولو او د 60 ثانیو لپاره وورتیکس کولو سره استخراج شو. د مرحلې جلا کول د 5 دقیقو لپاره په 15,700 RCF کې د سینټرفیوګیشن لخوا هڅول شوي. د جوړونکي د پروتوکول له مخې، د C18 سپن کالم (ترمو فشر ساینټیفیک، انګلستان) د پیپټایډ لرونکي ښکته پړاو په احتیاط سره د اسپریټ او ډیسالټ کولو لپاره کارول شوی و. د ویکیوم سینټرفیوګیشن له لارې وچولو وروسته، نمونه په 0.5٪ TFA او 3٪ اسیتونټریل کې منحل شوه، او 500 ng د نانو فلو RP کروماتګرافي لخوا تحلیل شو چې د ډله ایز سپیکٹرومیټري سره یوځای د سیسټم پیرامیټرو په کارولو سره چې مخکې تشریح شوي وو.
د پروټین پیژندنې او مقدار معلومولو لپاره د MaxQuant v.1.5.3.30 (56) څخه کار واخلئ ترڅو د Rps. palustris proteomes ډیټابیس (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) لټون وکړئ. د ډله ایز سپیکٹرومیټري پروټومکس ډیټا د PRIDE ملګري ذخیره (http://proteomecentral.proteomexchange.org) له لارې د ډیټاسیټ پیژندونکي PXD020402 لاندې د پروټوم ایکس چینج اتحاد کې زیرمه شوې ده.
د RPLC لخوا د تحلیل لپاره د الیکټرو سپری آیونیزیشن ماس سپیکٹرومیټري سره یوځای، RC-LH1 کمپلیکس د وحشي ډول Rps څخه چمتو شوی و. د مخکې خپاره شوي میتود (16) په کارولو سره، د پالستریس حجرو کې تولید شوي پروټین غلظت په 20 mM هیپس (pH 7.8)، 100 mM NaCl او 0.03٪ (w/v) β- (بایو-راډ تحلیل)) DDM کې 2 mg ml-1 و. د جوړونکي پروتوکول سره سم، د باران میتود لخوا د 10 μg پروټین استخراج لپاره د 2D پاکولو کټ (GE روغتیا پاملرنې، USA) وکاروئ، او په 20 μl 60٪ (v / v) فارمیک اسید (FA)، 20٪ (v / v) Acetonitrile او 20٪ (v/v) اوبو کې ورښت حل کړئ. پنځه مایکرو لیټرونه د RPLC (Dionex RSLC) لخوا د ډله ایز سپیکٹرومیټري (Maxis UHR-TOF، Bruker) سره یوځای تحلیل شوي. د 60 درجو سانتي ګراد او 100μlmin -1 کې د جلا کولو لپاره د MabPac 1.2×100 ملي میتر کالم (ترمو فشر ساینسي، انګلستان) وکاروئ، د 85٪ (v / v) محلول A [0.1٪ (v / v) FA او 0.02٪ (V/v) آبي محلول] څخه تر 85٪ (v/v) محلول B [0.1٪ (v/v) FA او 0.02٪ (v/v) په 90٪ (v/v) اسټونایټریل TFA کې د 90٪ (v/v) اسټونایټریل TFA کې د 85٪ (v/v) محلول B [0.1٪ (v/v) FA او 0.02٪ (v/v) سره د جلا کولو لپاره. د 60 دقیقو څخه ډیر وخت لپاره د معیاري الیکټرو سپری آیونیزیشن سرچینې او ډیفالټ پیرامیټرونو په کارولو سره، د ډله ایز سپیکٹرومیټر له 100 څخه تر 2750 m/z (د ډله ایز چارج تناسب) ترلاسه کوي. د ExPASy بایو انفارمیټکس سرچینې پورټل FindPept وسیلې (https://web.expasy.org/findpept/) په مرسته، د ډله ایز سپیکٹرم د کمپلیکس فرعي واحدونو ته نقشه کړئ.
حجرات د 72 ساعتونو لپاره د 100 ملی لیتر NF-ټيټ (10μMm-2 s-1)، متوسط ​​(30μMm-2 s-1) یا لوړ (300μMm-2 s-1) رڼا لاندې وده شوي. M22 متوسط ​​(M22 متوسط ​​چې پکې امونیم سلفیټ پریښودل شوی او سوډیم سوکسینټ د سوډیم اسټیټ لخوا بدل شوی) په 100 ملی لیتر سکرو ټاپ بوتل کې (23). په پنځو 30-s دورو کې، 0.1 مایکرون شیشې مڼې د 1:1 حجم تناسب سره مڼې شوې ترڅو حجرې لایز کړي او د 5 دقیقو لپاره په یخ کې یخ شي. نه حل کیدونکی ماده، نه ماتیدونکي حجرې او د شیشې مڼې د 16,000 RCF په سینټرفیوګیشن سره د بینچ ټاپ مایکرو سینټرفیوج کې د 10 دقیقو لپاره لرې شوي. غشا په Ti 70.1 روټر کې د 100,000 RCF سره په 20 mM tris-HCl (pH 8.0) کې د 40/15٪ (w/w) سوکروز ګریډینټ سره د 10 ساعتونو لپاره جلا شوه.
لکه څنګه چې زموږ په تیرو کارونو کې تشریح شوي، د PufW (16) په اړه د His ټګ معافیت کشف. په لنډه توګه، پاک شوی کور کمپلیکس (11.8 nM) یا هغه غشا چې د RC ورته غلظت لري (د اکسیډیشن لخوا ټاکل کیږي چې د کم شوي توپیر سپیکٹرم کموي او د رنګ شوي جیل بار سره سمون لري) په 2x SDS بارولو بفر (مرک، انګلستان) کې دوه ځله کم شوی. پروټینونه د 12٪ bis-tris NuPage جیل (ترمو فشر ساینسي، انګلستان) په نقل کې جلا شوي. یو جیل د کوماسي بریلینټ نیلي (بایو-راډ، انګلستان) سره رنګ شوی ترڅو د RC-L فرعي واحد بار او تصور کړي. په دوهم جیل کې پروټین د معافیت لپاره میتانول فعال شوي پولی وینیلایډین فلورایډ (PVDF) جھلی (ترمو فشر ساینسي، انګلستان) ته لیږدول شوی. د PVDF غشا په 50 mM tris-HCl (pH 7.6)، 150 mM NaCl، 0.2% (v / v) Tween-20 او 5% (w / v) سکیم شوي شیدو پوډر کې بنده شوه، او بیا د انټي-هیس لومړني انټي باډي سره (د انټي باډي بفر [50 mM tris-HCl (pH 7.6)، 150 mM NaCl او 0.05% (v / v) Tween-20] په 1:1000 A190-114A، بیتیل لابراتوارونو، متحده ایالاتو کې) د 4 ساعتونو لپاره انکیوبیټ شوه. د انټي باډي بفر کې د 5 دقیقو لپاره د 3 ځله مینځلو وروسته، غشا د هارسریډیش پیرو آکسیډیز (سیګما-الډریچ، انګلستان) سره یوځای شوه د موږک ضد ثانوي انټي باډي (په انټي باډي بفر کې 1:10,000 کم شوی) د کشف کولو اجازه ورکولو لپاره انکیوبیټ کړئ (په انټي باډي بفر کې د 3 مینځلو وروسته 5 دقیقې) د WESTAR ETA C 2.0 کیمیلومینیسینس سبسټریټ (سیاناجن، ایټالیا) او امرشام امیجر 600 (GE روغتیا پاملرنې، انګلستان) په کارولو سره.
د هر رنګ شوي جیل یا امیونوسای لین د شدت ویش رسمولو سره، د څوکې لاندې ساحه یوځای کول او د RC-L (داغ شوي جیل) او پروټین-W (ایمونوسای) د شدت تناسب محاسبه کول، په ImageJ کې (57) انځور پروسس کړئ. دا تناسب د دې فرض کولو سره چې په خالص RC-L کې د پروټین-W تناسب 1:1 و او د ټول ډیټا سیټ مطابق نورمال کول، د مولر تناسب ته بدل شوي.
د دې مقالې لپاره د اضافي موادو لپاره، مهرباني وکړئ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 وګورئ
دا یوه خلاصه لاسرسی لرونکې مقاله ده چې د کریټیو کامنز انتساب جواز شرایطو لاندې ویشل شوې ده. دا مقاله په هر ډول رسنۍ کې غیر محدود استعمال، ویش، او تکثیر ته اجازه ورکوي په دې شرط چې اصلي کار په سمه توګه حواله شوی وي.
یادونه: موږ یوازې له تاسو څخه غوښتنه کوو چې خپل د برېښنالیک پته ورکړئ ترڅو هغه کس چې تاسو یې پاڼې ته وړاندیز کوئ پوه شي چې تاسو غواړئ چې دوی برېښنالیک وګوري او دا سپیم نه دی. موږ به هیڅ برېښنالیک پته ونه نیسو.
دا پوښتنه د دې لپاره کارول کیږي چې تاسو لیدونکي یاست او د اتوماتیک سپیم سپارلو مخه ونیسئ.
ډیویډ جي کی سوینزبري، پارک کیان، فیلیپ جي جیکسن، کیټلین ایم فاریس، داریوس ایم نیډزویډزکي، الیزابت سي مارټین، ډیویډ اې فارمر، لورنا اې مالون، ربیکا ایف ټامپسن، نیل اې رانسن، ډینیل پي کینیف، مارک جي ډیکمن، ډیوي هولټن، کریسټین کرمیر، انډریو هیچکاک، سي نیل هنټر
د غبرګون په مرکز کې د رڼا جال ۱ کمپلیکس لوړ ریزولوشن جوړښت د کوینون متحرکاتو په اړه نوي بصیرتونه وړاندې کوي.
ډیویډ جي کی سوینزبري، پارک کیان، فیلیپ جي جیکسن، کیټلین ایم فاریس، داریوس ایم نیډزویډزکي، الیزابت سي مارټین، ډیویډ اې فارمر، لورنا اې مالون، ربیکا ایف ټامپسن، نیل اې رانسن، ډینیل پي کینیف، مارک جي ډیکمن، ډیوي هولټن، کریسټین کرمیر، انډریو هیچکاک، سي نیل هنټر
د غبرګون په مرکز کې د رڼا جال ۱ کمپلیکس لوړ ریزولوشن جوړښت د کوینون متحرکاتو په اړه نوي بصیرتونه وړاندې کوي.
© 2021 د ساینس د پرمختګ لپاره امریکایی ټولنه. ټول حقونه خوندي دي. AAAS د HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef او COUNTER شریک دی. ساینس پرمختګ ISSN 2375-2548.